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——国家药监局关于将牛角膜浑浊度和渗透性试验方法等5项方法纳入化妆品安全技术规范（2015年版）的通告（2025年第32号） 附件4 Skin Absorption: In vitro Method 1 范围 本方法规定了皮肤吸收体外试验的基本要求和方法。 本方法适用于单一成分的化妆品用化学原料。 2 试验目的 预测和评价化妆品用化学原料在离体皮肤中的经皮吸收率。 3 定义 3.1 受试物 test substances 被测试的化妆品原料，为单一化学物质。 3.2 吸收量 absorbed dose 在一定时间内透过皮肤的受试物的量。 4 试验原理 在特定条件下，将受试物（可以是放射标记物）暴露于扩散池中的皮肤表面一定时间后，采用适当的清洗程序和方法除去皮肤表面的受试物。在整个试验过程中，设置不同的时间点采集接收液，采用适当的方法测定受试物或其代谢产物。 当受试物具有代谢活性时，可以分析受试物的代谢活性产物，试验结束后，采用适当的方法测定受试物及其代谢产物的分布情况。 在本方法所描述的条件下，收集接收液和试验皮肤中的所有受试物，监测给定时间内受试物的吸收情况（一般试验周期为24 h）。应同时测定皮肤表面清洗液中的受试物、留在皮肤里的受试物、接收室中接收液里的受试物，得到受试物在各接收液里的分布和总体回收率。残留在皮肤角质层中的受试物可能会被吸收，参考本方法6数据处理和计算部分判定角质层的残留量是否计入皮肤吸收率。 5 试验方法 5.1 扩散池 扩散池由供给室和接收室组成（示例图见图1），离体皮肤放置于两者之间。扩散池的供给室和接收室之间应有良好的密封性，能较好控制扩散池及其内容物的温度，并保证与皮肤接触的接收液混合良好和取样方便（静态式或流通池式扩散池均可使用）。正常情况下，供给室在暴露于有限剂量受试物过程中保持开放，但在无限剂量和部分有限剂量的情况下，供给室可以封闭。
图1 一种用于皮肤吸收体外试验的直立式扩散池示例图 5.2 接收液 接收液应优先选择有益于生理的溶液，需提供接收液的精确组分，并证实受试物在接收液中能充分溶解，不影响皮肤吸收和完整性。在循环流动系统中，流速不能妨碍受试物扩散进入接收液。在静态渗透式系统中，接收液应连续搅拌。如果研究受试物在皮肤中的代谢效应，接收液必须能维持整个试验过程中皮肤的代谢活性。 5.3 皮肤制备 皮肤来源为动物，首选小型猪。须符合我国相关伦理要求，首选活性皮肤，也可以使用非活性皮肤，应证明皮肤的完整性。采用表皮层（酶、热或化学分离的）或用植皮刀分离的皮肤均可以使用。应避免使用太厚的皮肤，除非特殊受试物需使用全层皮肤测试。同时还应明确皮肤种类、解剖位置以及制备技术。 5.4 皮肤完整性 应正确制备和储存离体皮肤，使用前检查皮肤及其屏障的完整性。研究受试物在皮肤的代谢作用时，应使用新鲜皮肤，并确保其在试验过程中的代谢活性。一般新鲜的离体皮肤应在24 h内使用，也可证明在合理可行的情况下，根据代谢酶系统和贮藏温度的不同而做适当调整，但在使用前应测试和证明其屏障功能的完整性。 5.5 受试物制备 受试物可以采用放射性标记或使用其他定量方法。受试样品的制备尽可能与实际使用的状态保持一致，偏离使用情况的制备应做合理说明。受试物每个浓度要设置3个平行皮肤（皮肤来自同一个体），至少进行4次重复试验（皮肤来自不同个体）。 5.6 受试物浓度和组成 通常将受试物配制成系列浓度，其浓度范围应覆盖人体实际接触的可能暴露范围。受试物配制过程中需确保其稳定性和均一性，对于固体、半固体制剂和混悬液，需验证受试物在溶媒中的均匀性。 5.7 皮肤暴露 根据人体可能接触受试物的情况，常选择有限剂量暴露。剂量应模仿人体暴露量，通常固体受试物为2 ～ 5 mg/cm2，液体受试物最高为10 µL/cm2。实际剂量可根据预期的上样条件、研究目标或受试物的物理特性进行调整。如皮肤用量为无限剂量时，单位面积的剂量可以加大。 5.8 温度 受试物皮肤吸收一般属于被动吸收，受温度的影响较大，因此试验时扩散池和皮肤应保持恒定接近于皮肤正常温度32 ± 1 ℃。不同的扩散池可根据自身情况调整水浴或干加热参数到一定温度，以确保离体皮肤温度在其正常生理标准范围内。实验室相对湿度保持在30 ～ 70%之间。 5.9 暴露时间和取样 一般情况下接收液的采样点应满足能够以作图形式表现受试物的透皮吸收情况。根据受试物理化性质结合预试验确定合适的采样频率，试验周期内通常需要6 ～ 12个采样点。 5.10 样品分析 对试验系统的所有组成部分均应进行分析测定，以确定回收率。其中包括供给室、皮肤表面、皮肤中、接收液/池中的所有受试物。试验应得到足够的回收率，放射性标记试验的回收率应为100 ± 10%，其他定量方法建议回收率应为100 ± 15%，若偏离应合理解释，必要时重新进行试验。 6 数据处理和计算 应列出接收液的分析结果，不同时间内受试物在试验系统中的分布和吸收情况。对于有限暴露剂量，应计算皮肤洗液中受试物的量、与皮肤结合的数量（分析不同皮肤层）以及接收液中受试物的量。经皮吸收试验的结果有时只能用接收液的数据表示，对于受试物在试验结束时仍残留于皮肤内的情况，总的吸收量要考虑是否扣除角质层含量，并结合化合物作用位置和透过特性给出合理解释。无限剂量暴露试验时不做吸收百分比的计算。 回收率计算公式： 回收率=（清洗液中的量+皮肤中的量*+接收液中的量）/皮肤加样量x100%） 注：*代表皮肤中的量包含角质层、活性表皮层和真皮层的总和
皮肤吸收率计算公式： 皮肤吸收率=（皮肤中的量#+接收液中的量）/皮肤加样量x100%） 注：#是否去除角质层应给予合理说明 |
