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——国家药监局关于将牛角膜浑浊度和渗透性试验方法等5项方法纳入化妆品安全技术规范（2015年版）的通告（2025年第32号） 附件3 体外皮肤变态反应 动力学直接多肽反应试验方法 In Chemico Skin Sensitisation: Kinetic Direct Peptide Reactivity Assay (kDPRA)
1 范围 本方法规定了动力学直接多肽反应试验的基本原则、试验方法和技术要求。 本方法用于化妆品用化学原料的皮肤致敏性评价，适用于单一成分物质、多成分物质和已知成分及含量的混合物。 2 试验目的 预测和评价化妆品用化学原料是否具有潜在的皮肤致敏性及其分级。 3 定义 3.1 多肽消耗百分比percent peptide depletion 与溶剂对照相比，受试物消耗多肽的程度。 3.2 单一成分物质 mono-constituent substance 组成可定量的物质，单一主要成分含量至少为80%（w/w）。 3.3 多成分物质multi-constituent substance 组成可定量的物质，其中含有两种或两种以上主要成分，每种主要成分的含量≥10%（w/w）和< 80%（w/w）。多成分物质是制造过程产生的。 3.4 混合物 mixture 由两种或两种以上不发生化学反应的化学物质组成的固体或液体物质。 4 试验原理 试验基本原理同直接多肽反应试验（DPRA），有致敏性的受试物与多肽模拟的皮肤蛋白（本试验仅使用半胱氨酸多肽）共同孵育，导致多肽量减少。不同于DPRA仅测试化学物质一个浓度和一个时间点，kDPRA以时间和浓度依赖的方式量化评价被测物质的多肽结合反应性。被测物质采用5个浓度与半胱氨酸多肽溶液孵育不同时间（6个时间点）后，通过添加单溴二胺（Monobromobimane，mBrB，CAS 74235-78-2）与未结合的半胱氨酸多肽形成荧光复合物，来测量多肽的剩余量。如某时间点未结合多肽百分比的自然对数与受试物浓度呈线性关系（准一级反应），则通过斜率绝对值求得反应速率常数k，换算成对应时间点的反应动力学常数kt（单位：M-1s-1），并计算各时间点lgkt，以其中最大值lgkmax进行结果判断，评价受试物的皮肤致敏性。 5 试剂和受试物制备 5.1 多肽片段与纯度 半胱氨酸多肽：Ac-RFAACAA-COOH，分子量：751.35，纯度：≥95%。 5.2 阳性对照物 阳性对照物常用肉桂醛（CAS 104-55-2；纯度≥95%）。 5.3 受试物 5.3.1 溶剂的选择 溶剂首选乙腈，其次是pH 7.5的磷酸盐缓冲液。二甲基亚砜可能导致肽二聚化，应避免使用。 5.3.2 受试物溶液的配制 进行试验前，应评估受试物的溶解度。溶解性可用肉眼鉴别，应形成澄清透明的溶液。一般受试物最大配制浓度为20 mM（应完全溶解），对应反应体系终浓度为5 mM。试验时用溶剂连续稀释以获得20、10、5、2.5和1.25 mM系列浓度的受试物溶液。 20 mM的受试物溶液应于试验当日配制，否则应证明储存不影响其稳定性。通常配制量为5 mL，受试物（阳性对照）理论称取量为分子量×0.1 mg（以纯物质计）。 kDPRA在技术上适用于成分和含量明确的多成分物质和混合物的测试，此时，可以根据不同组分（不包括水）的占比和分子量计算受试物总的纯度和单一的表观分子量，用于计算制备20 mM溶液的取样量。 5.3.3 阳性对照溶液的配制 按受试物溶液的配制方法，用乙腈溶解阳性对照物制成20 mM浓度的溶液，并稀释得到20、10、5、2.5和1.25 mM系列浓度的溶液。 5.4 多肽贮备液的配制 称取适量半胱氨酸多肽，用pH 7.5的磷酸盐缓冲液配制成0.667 mM（0.501 mg/mL）的溶液。孵育前新鲜配制，配制时使用涡旋仪震荡溶解，必要时可用超声溶解，应在冰浴中进行，防止多肽降解。 pH 7.5磷酸盐缓冲液：取0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液18 mL，加0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液82 mL混合，测定pH值，应在7.50 ± 0.05之间。若偏酸性，加入0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液进行调节。若偏碱性，加入0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液进行调节，4℃保存，可在4周内使用。 5.5 单溴二胺溶液的配制 称取8.1 mg单溴二胺置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制成3 mM单溴二胺溶液。现用现配，避光保存。
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