附录 皮肤吸收体外试验方法应用示例（咖啡因） 1 试验目的 本次试验根据《皮肤吸收体外试验方法》文件中的基本原则，参考相关文献中具体方法，研究咖啡因在离体猪皮肤的吸收特性，定量分析咖啡因的透皮吸收率。本试验是以水溶性成分咖啡因为研究对象获得其皮肤透过率，因角质层中咖啡因含量较少，故在计算皮肤吸收率时未计入皮肤吸收量中。 条件不同数据会产生变化，本示例中的所有设备参数仅供参考。 2 受试物和皮肤类型 试验使用咖啡因（MW = 194.2 Dal，Log Po/w = -0.07，水中溶解度 = 21.6 mg/mL 25 ℃）作为受试物。 皮肤模型：3月龄巴马小型猪背部或腹部皮肤。 贮藏条件：制备后-20 ℃冻存，10天内用完，冻融不超过2次。 3 试剂和设备耗材 3.1 试剂 生理盐水、甲醇（色谱级）、磷酸（色谱级）。 3.2 设备 透皮吸收扩散仪（配备适宜的池体，能保证受试物于接收液中均匀扩散）、超高效液相色谱仪、经皮水分流失测定仪、涡旋混匀器、离心机。 3.3 耗材 色谱柱、离心管、2 mL进样瓶、移液器、枪头、0.22 µm尼龙滤膜、皮肤胶带、刀片、取皮刀、外科剪刀、1 mL注射器、吸水纸、棉签、离体猪皮。 4 试验方法 4.1 受试物制备 经预试验研究确定，配制0.1%、0.3%、1.0%三种浓度咖啡因溶液。取样该溶液，经前处理、稀释等步骤，用液相检测并计算溶液中咖啡因实际含量，用以计算实际加样量。将配好的咖啡因溶液在试验条件下放置24 h取样，检测咖啡因含量有无变化。 4.2 接收液 保证其满足漏槽条件，即接收液的体积至少是咖啡因达到饱和溶解时所需介质体积的3 ～ 10倍。配制好的接收液pH值应保持在pH 6.5 ～ 7.5范围内。根据溶液中咖啡因浓度和加样体积估算不同时间点的可能最高和最低浓度设计浓度曲线，于0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h取样，测定咖啡因在接收液中的稳定性。 4.3 离体猪皮的制备 离体猪皮采自猪背或腹侧皮肤，符合相关动物伦理要求，保证猪皮角质屏障的完整性（如不可采用热水淋洗或刮毛，以确保皮肤角质层完整性等）。用吸水纸吸干皮肤表面生理盐水，制成肉眼观察未受损伤、面积大小合适的皮肤备用。本试验中同一浓度受试物设置3个平行皮肤（皮肤来自同一个体）重复4次（皮肤来自不同个体）。 4.4 皮肤完整性检查 使用经皮水分流失仪测定猪皮角质层经皮水分流失值（TEWL）<15 g/m2/h的皮肤才可用于试验。加入受试物前调整温度到32 ± 1 ℃并保持稳定，将皮肤固定在扩散池的供给室和接收室之间，皮肤角质层朝向供给室，真皮层一侧朝向接收室，并通过补液管向接收室中加入接收液，去除接收液与皮肤间的气泡，确保猪皮与接收液完全接触，开启磁力搅拌器，转速设为600 rpm，扩散池体系在此状态下平衡30 ～ 45 min。 5 试验步骤 5.1 上样 向接收室中加入接收液。通过加样管加入接收液并准确记录接收液体积。接收液注入接收室后，去除皮肤与接收液接触面滞留的气泡，确保皮肤与接收液完全接触。该扩散池体系在正常试验条件下平衡30 ～ 45 min，验证皮肤完整性之后，方可加样处理。 向供给室中皮肤表面加入咖啡因测试溶液，并设置不含咖啡因的生理盐水作为阴性对照。用移液器按照10 µL/cm2的比例，将根据供给室内径面积计算所得体积的咖啡因溶液，均匀涂布于皮肤表面。 试验期间保持实验室环境湿度为30 ～ 70% RH。设置磁力搅拌器以600 rpm的速度搅拌，保持32 ± 1 ℃恒温水浴。 5.2 取样 分别于0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h时间点用注射器/自动取样装置取样，具体取样体积可根据预试验结果自行确定。0.22 µm尼龙滤膜过滤后待测。 供给室清洗：暴露结束后每次使用1 mL生理盐水清洗15次，将所有清洗液合并待测。 皮肤表面残留受试物清洗：皮肤暴露24 h后每次使用3 mL生理盐水清洗3次，将所有清洗液合并震荡，使用0.22 µm尼龙滤膜过滤后待测。 角质层：受试皮肤在干燥条件下，使用皮肤胶带进行角质层取样，重复20次。取样后将所有20张胶带置于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇震荡过夜提取、离心，提取液过滤后待测。 除去角质层后的皮肤：去除角质层后的皮肤剪碎，加入10 mL甲醇过夜提取，离心取上清液过滤后待测。 5.3 检测 仪器：超高效液相色谱仪（UPLC） 色谱柱：C18反相色谱柱 流动相：A（0.1%磷酸水溶液）和B（0.1%磷酸甲醇溶液） A:B=9:1 流速：0.25 mL/min 进样量：2 μL 柱温：30 ℃ 时间：14 min 检测波长：280 nm 6 数据分析 6.1 皮肤吸收率 皮肤吸收率=皮下渗透量/皮肤加样量x100%=（Q+N）/皮肤加样量x100% 其中Q：接收液中咖啡因总量；N: 除角质层皮肤中咖啡因总量。 6.2 累计皮下渗透量Qn
其中Cn：各时间点浓度；Ci：样品收集时间点i的浓度，i为1 ～ n - 1；Vi：各样品收集时间点i的取样体积1 mL；V0：接收池体积为8 mL。 6.3 回收率 回收率=（Q+W+M+N）/皮肤加样量x100% 其中Q：接收液中咖啡因总量；W：皮肤表面残留受试物+供给室中咖啡因总量；M：角质层中咖啡因总量；N：除角质层后皮肤中咖啡因总量；回收率应在100 ± 15 %范围内。 |
