化妆品安全技术规范 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验方法

化妆品安全技术规范（2015年版）  体外哺乳动物细胞染色体畸变试验方法

In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test

1 范围

本方法规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。

本方法适用于评价化妆品原料及其产品的致突变性。

2 试验目的

本试验用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。

3 定义

3.1 染色体型畸变 chromosome-type aberration

染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。

3.2 染色单体型畸变 chromatid-type aberration

染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。

3.3 染色单体裂隙 chromatid gap

单个染色单体上出现的无染色质的区域，其宽度小于染色单体的横截面的宽度。其中存在染色单体的最小错位。

3.4 染色单体断裂 chromatid break

染色单体的不连续，其中有一条明显的不对称染色单体。

3.5 多倍体 polyploidy

整个染色体组的细胞或生物体中的染色体数目畸变，而不是单个染色质或染色体（非整倍体）。

3.6 核内复制 endoreduplication

DNA复制的S期末，细胞核没有进入有丝分裂，而开始另一个S期的过程，其结果是染色体具有4，8，16，…，个染色单体。

3.7 有丝分裂指数mitotic index

中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值，是一项反映细胞增殖程度的指标。

4 试验基本原则

在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。

大部分的致突变剂导致染色单体型畸变，偶有染色体型畸变发生。虽然多倍体的增加可能预示着有染色体数目畸变的可能，但本方法并不适合用于测定染色体的数目畸变。

5 试验方法

5.1 试剂和受试物制备

5.1.1 对照组

5.1.1.1 阳性对照：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、可重复的阳性结果。当外源性代谢活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（Methyl methanesulphonate, MMS）、丝裂霉素C（Mitomycin C）、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-Nitroquinoline-N-Oxide）、阿糖胞苷（Cytosine arabinoside）。当外源性代谢活化系统存在时，可使用苯并［a］芘（Benzo［a］pyrene）、环磷酰胺（Cyclophosphamide）。

5.1.1.2 阴性对照：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其他处理和受试物组完全相同。

5.1.1.3 空白对照：如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。

5.1.2 受试物

5.1.2.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应临用现配，否则需证实贮存不影响其稳定性。受试物的配制过程应无菌操作，保证受试物的无菌性。

5.1.2.2 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S₉活性。首选溶剂是培养液（不含血清）或水。二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，使用时浓度一般不大于0.5%。

5.1.2.3 受试物浓度设置

（1）最高浓度的选择：

决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗透压摩尔浓度（osmolality）的改变。应通过预试验获得正式试验的最高受试物浓度。

（2）细胞毒性的确定：

应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在的两种条件下确定细胞毒性，例如存活细胞计数（viable cell counts）或有丝分裂指数（mitotic index）。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。