| ——国家药监局关于将《化妆品中三价铬和六价铬的检验方法》等8项方法纳入化妆品安全技术规范的公告（2026年第51号）
附件6
化妆品安全技术规范（2015年版） 细菌回复突变试验方法 Bacterial Reverse Mutation Test 1 范围 本方法规定了细菌回复突变试验的基本原则、要求和方法。 本方法适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。 2 定义 2.1 基因突变 gene mutation 在化学致突变物作用下DNA中碱基对的排列顺序发生变化。 2.2 回复突变 reverse mutation 细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型（prototroph）。 2.3 细菌回复突变试验 bacterial reverse mutation assay 利用一组组氨酸或者色氨酸缺陷型试验菌株测定引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的氨基酸缺陷型回复突变为原养型的试验方法。 3 原理 组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；色氨酸营养缺陷型大肠杆菌不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。 4 仪器和设备 培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、超低温冰箱（-80 ℃）或液氮生物容器、普通冰箱、天平、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机、玻璃器皿、生物安全柜等。 5 培养基和试剂 5.1 0.5 mmol/L组氨酸－0.5 mmol/L色氨酸－0.5 mmol/L生物素溶液
配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后115 ℃高压灭菌20 min。储存于4 ℃冰箱。若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸。 5.2 顶层琼脂培养基
配制：上述成分混合后，121 ℃高压灭菌30 min。试验时，加入0.5 mmol/L组氨酸－0.5 mmol/L色氨酸－0.5 mmol/L生物素溶液20 mL。若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸。 5.3 Vogel-Bonner（V-B）培养基E
配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水/去离子水至1000 mL。121 ℃高压灭菌30 min。储存于4 ℃冰箱。 5.4 20%葡萄糖溶液
配制：加少量蒸馏水/去离子水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水/去离子水至1000 mL。115 ℃高压灭菌20 min。储存于4 ℃冰箱。 5.5 底层琼脂培养基
配制：将前两种成分121 ℃高压灭菌30 min后，再加入灭菌的后两种成分，充分混匀。按每皿25 mL制备平板，冷凝固化后倒置于37 ℃培养箱中24 h，备用。 5.6 营养肉汤培养基
配制：将上述成分混合后，121 ℃高压灭菌30 min。储存于4 ℃冰箱。 5.7 盐溶液（1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2）
配制：在水中溶解上述成分后，121 ℃高压灭菌30 min。储存于4 ℃冰箱。 5.8 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）
配制：溶解上述成分后，121 ℃高压灭菌30 min。储存于4 ℃冰箱。 5.9 S9混合液
配制：将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分，使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。如辅酶II、6-磷酸葡萄糖采用溶液，需根据加入量调整灭菌蒸馏水/去离子水的体积。S9混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。试验结束，剩余S9混合液应该丢弃。 5.10 菌株鉴定用和特殊用途试剂 5.10.1 组氨酸-色氨酸-生物素平板
注：制备无组氨酸或者色氨酸平板时，不添加组氨酸或者色氨酸，用蒸馏水/去离子水补齐体积。 配制：琼脂和水121 ℃高压灭菌30 min后，将灭菌的20%葡萄糖、V-B培养基E、组氨酸溶液和色氨酸溶液加进热的琼脂溶液中（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸馏水/去离子水改为944 mL），混匀。待溶液稍微冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。
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