化妆品安全技术规范 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验方法

（3）剂量设置：

①至少应设置3个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从产生毒性至几乎无毒性，最高浓度应满足②；通常浓度间隔系数不大于2 ～ 根下10。

②在收获细胞时，最高浓度原则上应达到55% ± 5%细胞毒性的剂量，即细胞系的相对细胞增长数（RICC）、相对群体倍增数（RPD），或原代培养的淋巴细胞有丝分裂指数（MI）降低到阴性对照组的45% ± 5%。不建议采用处理组细胞数量与对照组细胞数量比值（RCC）作为细胞毒性指标。

③若未观察到沉淀或明显细胞毒性，对单一成分物质（组成可定量的物质，单一主要成分含量至少为80%，w/w）最高测试浓度应为10 mmol/L、2 mg/mL或2 μL/mL中的最低值。当受试物成分不确定时（如未知或成分可变的物质、复杂反应产物或生物材料等），若未观察到明显细胞毒性时，最高浓度应达到5 μL/mL、5 mg/mL、10 mmol/L或更高。对化妆品产品、植物提取物、复配原料等最高浓度应是5 μL/mL，5 mg/mL或10 mmol/L。

④对于不易溶解的物质，当低于最低可溶解浓度时仍无细胞毒性，选择的最高浓度应当在处理结束时仍可观察到浊度或沉淀（通过肉眼或倒置显微镜观察）。在高于最低可溶解浓度时出现细胞毒性时，建议测试一个出现浑浊或可见沉淀的浓度。当采用可产生沉淀的浓度测试时，应保证沉淀不影响试验操作（如染色、计数）。在试验前测定受试物在培养介质中的溶解度有利于该试验。

5.1.3 培养液：采用MEM（Eagle），并加入非必需氨基酸和抗菌药（青霉素，最终工作浓度为100 IU/mL；链霉素，最终工作浓度为100 μg/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可选用其他合适的培养液。

5.1.4 活化系统

通常使用S₉混合物（S₉ mix）。S₉是从经酶诱导剂（Aroclor 1254或苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合使用）处理的啮齿动物肝脏获得的。S₉的使用浓度为1%～10%（终浓度）。S₉ mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定，但需对S₉ mix的活性进行鉴定，必须能明显活化阳性对照物。也可使用下述方法配制：

也可使用经过活力确认的商品化S₉。

5.2 试验步骤

5.2.1 细胞：可使用已建立的细胞株或细胞系，也可使用原代培养细胞。所使用的细胞应该在生长性能、核型（包括染色体数目）、自发的染色体畸变率等方面有一定的稳定性。需定期检查细胞株的核型（包括染色体数目），检测有无支原体污染等。可使用多种细胞系，如中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、中国仓鼠肺细胞V79、中国仓鼠肺细胞（CHL）/IU、TK6或原代细胞培养物（包括人类或其他哺乳动物的外周血淋巴细胞）。所用细胞系的选择应具有科学依据。当使用原代细胞时，在符合人体伦理原则与法规的前提下，优先考虑使用人源原代细胞。

5.2.2 试验时，应同时设阳性对照、阴性对照和至少3个可供分析的受试物浓度组。应为每个受试物浓度组及对照组设置独立的平行培养物（通常至少2个）。必要时，应增设空白对照。

5.2.3 试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中，放CO₂培养箱内培养。

5.2.4 试验需在加入和不加入S₉ mix的条件下进行。试验时，吸去培养皿（瓶）中的培养液，加入一定浓度的受试物、S₉ mix（不加S₉ mix时，需用不含血清培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3 ～ 6 h。结束后，吸去含受试物的培养液，用Hanks液等洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱，于24 h内收获细胞（从处理开始算起，总时间约为1.5个正常细胞周期）。于收获前2 ～ 4 h，加入细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，作用时间为4 h，终浓度为1 μg/mL）。

当受试物为原料时，如果在上述加入和不加入S₉ mix的条件下均获得阴性结果，则尚需补加另外的试验，即在不加S₉ mix的条件下，使受试物与试验系统的接触时间延长至24 h（接触过程中需加入含10%胎牛血清的培养液）。

当难以得出明确结论时，应更换试验条件，如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重复试验。

5.2.5 收获细胞时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000 ～ 1200 r/min的速度离心5 ～ 7 min，弃去上清液，加入0.075 mol/L KCl溶液，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入37 ℃细胞培养箱中低渗处理。继而以新配制的甲醇和冰醋酸液（容积比为3:1）进行固定。空气干燥或火焰干燥法常规制片，用姬姆萨染液染色。

5.2.6 所有玻片（包括阳性和阴性对照玻片）在镜检分析染色体畸变前应进行独立编码。由于固定过程常导致一部分中期细胞丢失染色体，因此所计数的细胞中期分裂相染色体数为2n ± 2。2n指众数（modal number），即该细胞系最常见的染色体数目。

为获得准确的分析结果，每种浓度和对照至少应选择300个分散良好的中期分裂相细胞（平均分配至平行培养物中）。当观察到大量发生染色体畸变的细胞，并且受试物可明确为阳性时，计数的中期分裂相细胞数量可以减少（一般不少于100个）。

应计数具有结构染色体畸变（包括裂隙和不包括裂隙）的细胞。染色单体型和染色体型畸变应分别记录并按亚型（断裂、交换）分类。尽管本试验旨在检测结构染色体畸变，但当观察到多倍体和核内复制频率时，也应对其进行记录。

5.3 试验结果

应评估具有结构染色体畸变的细胞百分比。应按亚型（断裂、交换）分类的染色单体型和染色体型畸变，分别列出其在实验组和对照组中的数量及频率。裂隙应单独记录和报告，但不计入总畸变频率。当观察到多倍体和/或核内复制细胞时，应报告其百分比。

应记录主要畸变试验中所有处理组、阴性及阳性对照的同步细胞毒性测定数据。

5.4 统计处理：对染色体畸变细胞率进行统计学处理（χ2检验，Fisher精确概率检验等），以评价受试物的致突变性。

5.5 结果评价：在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中具有致突变性：

（1）  受试物引起染色体结构畸变数具有统计学意义，并有剂量相关性。

（2）  受试物在任何一个剂量条件下，引起具有统计学意义的增加，并有可重复性。

在评价时应把生物学和统计学意义结合考虑。

6 结果解释

阳性结果表明受试物引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变。

阴性结果表明在本试验条件下，受试物不引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变。