5.4 限值试验 在本项试验中，如在一个不低于1000mg/kg BW/d的剂量组未产生可观测到的毒性效应，且依据结构相似化合物已有信息预测未提示受试物具有毒性时，可考虑不必进行3个剂量水平的试验。但预期人体暴露量需要更高剂量（大于1000mg/kg BW/d）研究的情形除外。 5.5 受试物给予 试验开始前至少要有5 d检疫期并使实验动物适应实验室饲养环境。实验动物随机分组。可通过灌胃、掺入饲料或饮水途径给予受试物。原则上实验动物每周7 d给予受试物，连续至少90 d。如采用其他给予受试物方案（如每周5 d），应说明偏离标准方案的理由并提供支持性数据，明确论证所选方案能够满足研究既定目标。试验期间所有动物给予受试物的方式应完全相同。若为给予受试物的目的加入其他溶剂或添加剂，这些溶剂或添加剂不应影响受试物的吸收或引起毒性作用。恢复期卫星组动物于给予受试物90 d后停止接触受试物。 5.5.1 灌胃法 灌胃体积一般不超过10 mL/kg BW，且各组的灌胃体积相同，每日在大致相同时间灌胃，前4周每周称体重2次，之后每周称体重1次，根据体重调整灌胃体积。如为水溶液，最大灌胃体积可达到20 mL/kg BW。如为油性液体，灌胃体积应不超过4 mL/kg BW。当受试物使用溶媒配制时，对照组应给予相同体积的溶媒。 5.5.2 掺入饲料法 以不影响动物摄食、营养平衡为原则，将受试物与饲料充分混匀并保证受试物配制物的稳定性和均一性。受试物掺入量一般不超过5%（w/w），若超过5%时，应调整饲料营养素水平，使各剂量组与对照组饲料营养素水平一致。必要时可设置未处理对照组，以区分是由于适口性差还是由于毒性反应导致的食物摄入量减少。 5.5.3 掺入饮水法 以不影响动物饮水量为原则，将受试物与水混匀并保证溶液的稳定性和均一性。每日新鲜配制。 5.6 观察指标 5.6.1 临床观察 观察时间应至少为90 d。恢复期卫星组动物在给予受试物结束后继续观察至少28 d（具体时限应根据观察到的效应适当调整），不作任何处理，以了解毒性作用的可逆性、持续性及迟发性。每日应至少观察动物1次，观察时间段尽量相同，或在预期毒性反应出现的时间段观察，记录毒性反应的症状、发生时间、持续时间等。如果出现毒性反应，则应适当增加每日观察次数。试验期间，对体质弱的动物应分笼饲养，对濒死或死亡动物应及时观察并尽可能地采集标本进行检测，并分析原因。 观察应至少包括如下内容：皮肤和被毛的改变，眼和黏膜变化，呼吸、循环、植物神经和中枢神经系统，肢体运动和行为活动等改变。 5.6.2 体重、摄食量及饮水消耗量 应记录每周动物的体重，计算每周动物的摄食量。当采用饮水法给予受试物时，应准确记录动物每周饮水量。如受试物经掺入饲料或饮水给予动物时，应计算和报告受试物各剂量组实际摄入剂量（mg/kg BW）。 5.6.3 眼科检查 在首次给予受试物前、末次给予受试物后及恢复期观察结束时，至少应对最高剂量组和对照组动物进行眼科检查。若发现动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。 5.6.4 临床检查 试验结束后，动物应禁食过夜，麻醉后采血，用于血液学、血液生化检查。 5.6.4.1 血液学检查 在中期观察结束（如有设置）、试验结束、恢复期结束时进行检查。应测定血细胞比容、血红蛋白浓度、红细胞计数、网织红细胞计数、白细胞计数和分类、血小板计数、凝血功能（凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间，必要时可增加凝血酶时间和纤维蛋白原）。 5.6.4.2 血液生化检查 在中期观察结束（如有设置）、试验结束、恢复期结束时进行检查。血清或血浆检查指标包括电解质平衡、碳水化合物代谢、肝功能、肾功能等方面，具体指标包括：钠、钾、葡萄糖、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、尿素、尿素氮、肌酐、总蛋白和白蛋白、总三碘甲状腺原氨酸、总甲状腺素、促甲状腺刺激激素，以及至少两种反映肝功能的酶（如丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰基转移酶和山梨醇脱氢酶等）。 根据受试物的毒性特征和临床表现，必要时可测定其他酶（肝脏或其他来源）、胆汁酸、总胆红素、其他激素（如睾酮、雌二醇、卵泡刺激素、黄体生成素）。 如果受试物的已知特性可能或被怀疑会影响相关代谢谱，还应进行以下指标测定：钙、磷、甘油三酯、特定激素、高铁血红蛋白和胆碱酯酶等。 此外，还可根据所观察到的毒性作用进行其他更大范围的血液生化检查，以便进行全面的毒性评价。 |
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