6.1.1.2.1 动物种系的选择 选用健康啮齿类动物，推荐使用小鼠（近交系）或大鼠。如果已知受试物对其中一种性别的动物更敏感，则应使用这种性别的动物。雌性动物应未孕、未产。试验开始时每一性别的动物体重差异应控制在± 20%内。 6.1.1.2.2 动物的性别和数量 每一个剂量组和对照组至少应该有20只动物（雌雄各半）。若计划在试验过程中处死动物，则应增加计划处死的动物数。 6.1.1.2.3 饲养环境 实验动物和实验动物设施应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，不限制饮水量。 6.1.1.3 剂量分组 至少要设三个剂量组、一个溶剂对照组和一个阳性对照组，如果受试物采用未知免疫毒性的溶剂时，还应设立一个不作任何处理的空白对照组。高剂量应不使动物产生明显的应激、营养不良或死亡，但最好可使动物产生一些可测量的一般中毒表现。低剂量最好不使动物产生任何免疫毒性作用。阳性对照组可选用已知的免疫抑制剂（如环磷酰胺等）作为阳性对照物。 6.1.1.4 受试物给予 开始给予受试物前至少要有3 ~ 5 d时间使实验动物适应实验室饲养环境。实验动物随机分组。受试物或溶剂经口和/或经皮和/或经吸入给予，给予受试物途径一般与90 d重复剂量毒性试验的途径一致。每周给予受试物7 d，至少28 d。 6.1.1.5 临床观察 试验期间，每天对动物至少进行1次临床观察，记录毒性症状的出现时间、严重程度及其持续时间。观察应包括但不限于以下方面：皮肤、被毛；眼、黏膜；呼吸系统；自主性和中枢神经系统；循环系统；肢体运动功能；行为特征；抗感染能力等。 每周测量1次动物的摄食量。动物给予受试物前称体重，之后每周1次，处死前再次称体重。 任何濒死动物一被发现应与其他动物分开并被安乐死。对试验过程中任何濒死的或死亡的动物都应进行大体解剖。 6.1.1.6 试验方法 给予受试物结束前4 d，经静脉注射T细胞依赖性抗原绵羊红细胞（SRBCs），通过计数动物脾脏中特异性抗体生成细胞的数量来反映抗体的产量，可用于检测受试物对脾脏内产生抗体的细胞的毒性作用。试验时，应考虑如下因素： （1）注射T细胞依赖性抗原SRBCs，应对动物注射抗原后测定PFC的最佳时间作出评价。 （2）测定每批补体的活性。 （3）使用双盲法进行PFC计数。 （4）测定脾细胞的活性。 6.1.2 免疫球蛋白定量测定 6.1.2.1 受试物、实验动物、剂量分组、受试物给予方式及临床观察 同6.1.1.1 ~ 6.1.1.5。 6.1.2.2 试验方法 在给予受试物结束前4 d，用牛血清白蛋白免疫动物，2周后再次用抗原免疫动物，然后测定每只动物血清中IgG和IgM的滴度。测定抗体滴度的时间点应足够多（通常选择3 ~ 5个），以便对受试物组和对照组动物的初级抗体反应和次级抗体反应进行比较。测定抗体时受试物的给予时间至少为28 d。试验时，应考虑测定血清中IgG和IgM滴度的方法应足够敏感以便测得每只动物的IgG和IgM滴度。该试验评价受试物是否影响抗体对抗原的反应性。 6.2 特异性细胞免疫试验 采用下列3种试验方法中的任一种进行试验，评价给予受试物至少28 d对特异性细胞免疫反应的影响。如选择淋巴细胞增殖试验或细胞毒性T淋巴细胞检测，可与NK细胞活性共用一组动物。 6.2.1 淋巴细胞增殖试验 6.2.1.1 受试物、实验动物、剂量分组、受试物给予方式及临床观察 同6.1.1.1 ~ 6.1.1.5。 6.2.1.2 试验方法 可通过测量放射性标记物（一般为3H-胸腺嘧啶，简称3H-TdR）掺入DNA的量来说明淋巴细胞的增殖，也可采用MTT、BrdU-ELISA/FCM法等方法。该方法可以证明给予受试物至少28 d对同种异品系淋巴细胞刺激引起的淋巴细胞增殖能力的影响。采用3H-TdR掺入试验时，应对如下因素进行考虑： （1）应答细胞来自对照组和受试物组动物的脾细胞，在无菌条件下制备脾细胞。应答细胞的DNA合成没有采取阻断处理。 （2）刺激细胞来自未给予受试物的同种异品系动物的脾细胞，在无菌条件下制备脾细胞。刺激细胞的DNA合成用丝裂霉素或X线处理进行阻断。 （3）测定应答细胞和刺激细胞的活力。 （4）应设3份或4份对照，保证刺激细胞的非反应性、测定DNA合成的基础水平。 （5）对空白对照和溶剂对照同时进行测定。 （6）用每个培养皿中掺入应答细胞的放射性标记物的量来表示脾细胞的增殖程度，表示为每分钟居里数（curie per minute，CPM）。要计算净CPM（nCPM），即应答细胞被刺激细胞刺激后掺入的CPM均值减去未经刺激的脾细胞掺入CPM的均值。受试物组与对照组差异的百分比表示为：[1-（受试物组nCPM/对照组nCPM）]。 （7）不同的淋巴细胞增殖试验存在许多不同，应说明所引用的试验方法及详细的试验步骤，说明主要试剂的来源，最好也说明这些试剂的纯度。 （8）为了证明方法的灵敏性，应设立阳性对照组，给予已知的免疫抑制剂。 6.2.2 迟发型过敏（Delayed -type Hypersensitivity，DTH）反应 6.2.2.1 受试物 同6.1.1.1。 6.2.2.2 实验动物及饲养环境 选用近交系小鼠，如果已知受试物对其中一种性别的动物更敏感，则应使用这种性别的动物。雌性动物应未孕、未产。动物6 ~ 8周龄时开始试验，试验开始时每一性别的动物体重差异应控制在± 20%内。 动物的性别和数量、饲养环境同6.1.1.2。 6.2.2.3 剂量分组、受试物给予方式及临床观察 同6.1.1.3 ~ 6.1.1.5。
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