6.2.2.4 试验方法 在给予受试物结束前4 d，用牛血清白蛋白致敏动物，1 ~ 2周后用相同的抗原进行激发，激发后24 ~ 48 h，比较受试物组和对照组DTH反应的差异，以激发前后反应的差值来表示DTH的程度。该方法是一种检测受试物对实验动物诱导性DTH影响的体内方法。开展该试验时，应对如下因素进行考虑： （1）DTH检测方法有数种，如耳肿胀法、足跖增厚法等，应选用灵敏度高、可重复性好、并适用于所选用实验动物品系的方法；不同的方法中下列参数也可能不同，如致敏及激发动物所用抗原的性质，免疫注射的次数及途径，免疫激发的时间，同位素的使用等。试验时选用的这些参数及其他相关的参数应可以使所选用的实验动物产生足够的DTH反应。 （2）测定DTH反应前，应对动物给予受试物至少28 d。 6.2.3 细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T-lymphocyte，CTL）检测 6.2.3.1 受试物、实验动物、剂量分组、受试物给予方式及临床观察 同6.1.1.1 ~ 6.1.1.5。 6.2.3.2 试验方法 该方法用于证明给予受试物至少28 d对CTL生成的影响。常取动物脾淋巴细胞进行细胞毒性T淋巴细胞试验，检测采用放射免疫法或流式细胞术。放射法使用同种异品系肿瘤抗原对CTL进行诱导（体内或体外诱导），然后，来自受试物组和对照组动物的脾细胞与51Cr标记的同种异品系肿瘤细胞共孵育4 h后，肿瘤细胞所释放的放射性标记物的量可以说明T淋巴细胞溶解肿瘤细胞的能力。试验时，考虑如下因素： （1）应设立对照组来测定效应细胞不存在时靶细胞释放的放射性标记物的本底量和放射性标记物的总释放量。 （2）应可以证明试验中所选用的动物可产生CTLs，所选用的试验方法应适合于诱导动物CTL的生成。 （3）CTL检测有数种不同的方法，引用某一种方法时应做到完全引用，对方法进行修改时应予以说明，合适的情况下应说明主要试剂的来源、活性和/或纯度。 6.3 NK细胞的活性 6.3.1 受试物、实验动物、剂量分组、受试物给予方式及临床观察 同6.1.1.1 ~ 6.1.1.5。 6.3.2 试验方法 建议采用Reynolds和Herberman的微量培养法来检测给予受试物至少28 d对NK细胞活性的影响，也可采用LDH释放法等其他适合的方法。微量培养法是将受试物组和对照组动物的脾细胞与51Cr标记的YAC淋巴瘤细胞共培养。靶细胞与效应细胞共培养4 h后，靶细胞中释放的放射性标记物的量可用于表示NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力。LDH释放法是将受试物组和对照组动物的脾细胞与靶细胞（YAC细胞）共培养。靶细胞与效应细胞共培养4 h后，靶细胞中释放的乳酸脱氢酶含量可用于表示NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力。开展该试验时，应对如下因素进行考虑： （1）应设立几个对照以说明在没有效应细胞存在时，靶细胞释放放射性标记物或乳酸脱氢酶的本底量以及放射性标记物或乳酸脱氢酶总的释放量。 （2）试验可使用除YAC细胞之外的靶细胞，任何情况下都应测定靶细胞的存活力。 （3）引用某一种方法时应做到完全引用，对方法进行修改时应予以说明，合适的情况下应说明主要试剂的来源、活性和/或纯度；如果对所选用的方法作了一些修改，则应说明修改的科学性和合理性。 6.4 巨噬细胞检测 6.4.1 受试物、实验动物、剂量分组、受试物给予方式及临床观察 同6.1.1.1 ~ 6.1.1.5。 6.4.2 试验方法 评价给予受试物至少28 d对巨噬细胞数及其吞噬功能的影响。应对如下方面进行检测： （1）试验中应计数腹腔细胞的总数及分类计数。 （2）评价在有或没有促进因子（如γ-干扰素或细菌脂多糖）存在的情况下腹腔细胞对外源性物质（如鸡红细胞、荧光微球等）的吞噬作用。 （3）有数种不同的巨噬细胞检测方法，推荐鸡红细胞吞噬法和流式细胞法，也可采用巨噬细胞溶酶体酶测定、巨噬细胞表面受体检测法等，因此，应对所选用的方法进行描述并说明方法引证的来源；如果对所选用的方法作了一些修改，则应说明修改的科学性和合理性。 6.5 结果处理 （1）对于计数资料，表格应显示试验开始时各组动物数、出现免疫毒性反应的动物数、免疫毒性损伤的类型和每种损伤的动物百分比。 （2）对于计量资料，一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个试验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 （3）NK细胞活性需进行数据转换，X＝Sin-1 （4）以吞噬百分率或吞噬指数表示巨噬细胞的吞噬能力。吞噬百分率需进行数据转换，X＝Sin-1√，式中P为吞噬百分率，用小数表示，然后再进行方差分析。 6.6 结果评价 附加免疫毒性试验研究的结果应与初始筛选试验结果一起评估。在评价时应综合考虑生物学意义和统计学意义。评估包括： （1）对异常指标进行综合分析：与溶剂对照组比较是否存在统计学的显著差异，是否在背景数据范围内波动，受试物的剂量与异常指标的发生与否、发生率和严重性之间的关系，以及指标的相互关联性等，判断受试物是否引起了某一方面免疫功能异常。 （2）受试物组体液免疫试验、特异性细胞免疫试验、巨噬细胞检测、NK细胞活性四个方面中任一试验结果出现异常，均认为该受试物具有潜在的免疫毒性。 7 结果解释 免疫毒性试验能够提供受试物在反复接触机体后的毒性作用资料。其试验结果仅可在很有限的程度上外推到人，但它可为确定人群的允许接触水平提供有用的信息。 |
