附件2 牛角膜浑浊度和渗透性试验方法 Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Assay 1 范围 本方法规定了牛角膜浑浊度和渗透性试验的基本原则、要求和方法。 本方法适用于化妆品用化学原料的潜在不可逆眼损伤和无刺激性评价，适用于单一成分物质、多成分物质和已知明确成分及含量的混合物。 2 试验目的 本试验通过定量测定牛角膜浑浊度和渗透性的变化，评价化妆品用化学原料对眼角膜的不可逆眼损伤或无刺激性。 3 定义 3.1 眼睛刺激性 eye irritation 眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。 3.2 不可逆眼损伤 irreversible eye damage 眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。 3.3 角膜的浑浊度 corneal opacity 角膜暴露于受试物后通透性改变的程度，角膜浑浊度增加表明角膜受损。 3.4 角膜的渗透性 corneal permeability 测定通过角膜细胞层的荧光素钠染料的量来代表角膜上皮损伤的指标。 4 试验原理 牛角膜浑浊度和渗透性试验是牛角膜接触化妆品原料后，通过测定角膜浑浊度和渗透性的变化来评估化妆品用化学原料的眼刺激程度。 5 试剂和材料 5.1 培养液 MEM培养液 MEM培养液（含酚红） 5.2 Hanks’溶液 称取氯化钙140 mg、六水合氯化镁100 mg、七水合硫酸镁100 mg、氯化钾400 mg、磷酸二氢钾60 mg、碳酸氢钠350 mg、氯化钠8 g、磷酸氢二钠48 mg、葡萄糖1 g，加水至1 L。现用现配。 5.3 荧光素钠溶液 液体及表面活性剂受试物选用浓度为4 mg/mL，固体受试物选用5 mg/mL的荧光素钠溶液进行渗透性试验。 5.4 阳性对照物 液体受试物的阳性对照物可使用100%N,N-二甲基甲酰胺（CAS 68-12-2）；固体受试物的阳性对照物可使用20%咪唑（CAS 288-32-4）溶液。 20%咪唑溶液的配制：取固体咪唑20 g，加水至100 mL溶解并摇匀。 5.5 阴性对照物 阴性对照物可使用0.9%氯化钠溶液，也可根据受试物的性质选择蒸馏水或其他可证明对测试系统无影响的溶剂，需同时设立溶剂对照。 5.6 牛眼 发育成熟的牛眼，直径大于1.8 cm，选用6 ~ 60月龄的牛。 牛眼放在2 ~ 4 ℃的Hanks’溶液中，使用时间为24 h内。 5.7 浑浊度仪及角膜夹持器（见附录） 浑浊度仪是用来测量浑浊度的装置。根据浑浊度仪的光源不同，分为白光光源的浑浊度仪和单色光源的浑浊度仪。不同光源体外刺激分数的计算公式不同。 角膜夹持器由前室和后室两部分组成，前后室的内部直径均为1.7 cm，深度2.2 cm。 6 试验步骤 6.1 牛角膜的制备 剔除浑浊，有划痕、白斑、新生血管形成的牛眼。取无缺陷的牛眼，沿巩膜边缘2 ~ 3 mm剪取并剥离角膜，角膜内皮层向上，置于Hanks’溶液中。 6.2 角膜安装 角膜内皮层向下对准O型环放置在夹持器的后室上，再将前室盖在角膜上，前后室组合，旋紧。 6.3 角膜平衡 按先后室再前室的顺序，将32 ºC预热的MEM培养液加满夹持器的前后室，确保没有气泡，将固定好的角膜夹持器垂直放置于32 ± 1 ºC恒温设备中平衡1 h。 6.4 基准浑浊度的测定 角膜平衡后，按先前室再后室的顺序，吸出前后室培养液，重新加入预热的MEM培养液。浑浊度仪测定并记录每个角膜的浑浊度值，作为基准浑浊度。白光光度仪测定浑浊度小于7的角膜、单色光浑浊度仪测定值介于1200 lux到1850 lux之间的角膜为合格角膜。 6.5 角膜的分组 取基准浑浊度符合要求的牛角膜，每次试验设受试物组、阳性对照组和阴性对照组（必要时设置溶剂对照组），每组至少3只角膜。 6.6 受试物暴露 受试物暴露方式有两种，一种针对液体和表面活性剂（固体或液体），另一种针对非表面活性剂（固体）。 液体和表面活性剂（液体）以原液给样；半固体、乳霜和蜡通常按液体测试；表面活性剂（固体）配制成浓度为10%的液体进行测试。暴露时间为10 min。 非表面活性剂固体配制成浓度为20%溶液或混悬液给样，暴露时间为4 h。 溶剂除0.9%氯化钠溶液外，选择蒸馏水或其他溶剂时，需设溶剂对照。 根据受试物理化性质，给样方式有两种，一种直接给样法适用于非粘性到微粘性的液体化学品，另一种开窗给样法适用于半粘性和粘性液体化学品以及纯固体。确保测试受试物充分覆盖上皮表面，并在冲洗步骤中充分去除。 直接给样：取分组后带有角膜的夹持器，吸去前室液体，加入750 µL受试物于前室中，全部加样后，确保样品覆盖整个角膜，角膜内皮层朝下水平放置于32 ± 1 ºC恒温设备中。 开窗给样：吸去前室液体，用开窗器移除前室的玻璃片，夹持器前室在上，水平放置。用棉球轻轻吸干角膜上残存培养液，取750 µL受试物均匀平铺在角膜上，置于32 ± 1 ºC恒温设备中。
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