6 试验步骤
6.1 试验设计
试验设置受试物组（终浓度为0.31 mM、0.63 mM、1.25
mM、2.5 mM、5 mM）、阳性对照组（positive control，PC）、受试物对照组（substance control，SC）、溶剂对照组（vehicle control，VC）和空白对照组（blank control，BC），其中受试物组每个浓度3个重复，VC组、BC组12个重复，PC和SC每个浓度一个孔。以3个受试物（A、B、C）为例加样示例参见图1。
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A
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VC组（溶剂+0.5 mM多肽）
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B
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BC组（溶剂）
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C
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0.31 mM受试物A
+0.5 mM多肽
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0.31 mM受试物B
+0.5 mM多肽
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0.31 mM受试物C
+0.5 mM多肽
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0.31 mM受试物A+缓冲液
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0.31 mM受试物B+缓冲液
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0.31 mM受试物C+缓冲液
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D
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0.63 mM受试物A
+0.5 mM多肽
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0.63 mM受试物B
+0.5 mM多肽
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0.63 mM受试物C
+0.5 mM多肽
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0.63 mM受试物A
+缓冲液
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0.63 mM受试物B
+缓冲液
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0.63 mM受试物C
+缓冲液
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E
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1.25 mM受试物A
+0.5 mM多肽
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1.25 mM受试物B
+0.5 mM多肽
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1.25 mM受试物C
+0.5 mM多肽
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1.25 mM受试物A
+缓冲液
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1.25 mM受试物B
+缓冲液
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1.25 mM受试物C
+缓冲液
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F
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2.5 mM受试物A
+0.5 mM多肽
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2.5 mM受试物B
+0.5 mM多肽
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2.5 mM受试物C
+0.5 mM多肽
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2.5 mM受试物A
+缓冲液
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2.5 mM受试物B
+缓冲液
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2.5 mM受试物C
+缓冲液
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G
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5 mM受试物A
+0.5 mM多肽
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5 mM受试物B
+0.5 mM多肽
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5 mM受试物C
+0.5 mM多肽
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5
mM受试物A
+缓冲液
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5
mM受试物B
+缓冲液
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5
mM受试物C
+缓冲液
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H
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0.31 mM PC+0.5 mM多肽
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0.63 mM PC+0.5 mM多肽
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1.25 mM PC+0.5 mM多肽
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2.5
mM PC+0.5 mM多肽
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5
mM PC+0.5
mM多肽
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1.25 mM PC+缓冲液
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2.5
mM
PC+缓冲液
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5
mM PC+缓冲液
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10 mM PC+缓冲液
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20 mM PC+缓冲液
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图1 kDPRA反应板加样示例
6.2 操作步骤
每个反应时间分别准备应用板（受试物溶液稀释板）和反应板。应先准备反应板，随后立即准备含有受试物稀释液的应用板，并将各组受试物溶液立即加入到反应板中。
6.2.1 反应板的准备
使用黑色96孔板，参照图1准备各时间点的反应板。分别在A1～A12、C1-H1～C5-H5、C6～G6、C7-G7～C9-G9孔中加入120 μL 0.667 mM多肽溶液，在B1～B12、C10-G10～C12-G12、H8～H12孔中加入120 μL
pH7.5的磷酸盐缓冲液。
6.2.2 应用板的准备
准备2 mL深孔板，参照图2准备各时间点的应用板。分别在A行、B行、C行～ F行中每孔分别加入300 μL溶剂，将600
μL 20 mM受试物储存液加入G行。使用多通道移液器从G行吸取300 μL，加入F行，随后按同样方法依次稀释至C行。在H1 ～ H4每孔中每孔分别加入600 μL溶剂，将1200 μL 20 mM阳性对照物储存液加入H5孔。使用移液器从H5孔吸取600
μL，加入H4行，按同样方法依次稀释至H1。从H1 ～ H5中吸取300 μL溶液转移到H8 ～ H12孔。配制完成后及时用封板膜密封待用。
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A
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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B
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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溶剂
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C
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1.25 mM受试物A
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1.25 mM 受试物A
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1.25 mM受试物A
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1.25 mM受试物B
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1.25 mM受试物B
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1.25 mM受试物B
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1.25 mM受试物C
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1.25 mM 受试物C
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1.25 mM 受试物C
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1.25 mM 受试物A
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1.25 mM 受试物B
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1.25 mM 受试物C
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D
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2.5
mM
受试物A
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2.5
mM受试物A
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2.5
mM受试物A
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2.5
mM受试物B
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2.5
mM 受试物B
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2.5
mM受试物B
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2.5
mM受试物C
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2.5
mM 受试物C
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2.5
mM 受试物C
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2.5
mM 受试物A
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2.5
mM 受试物B
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2.5
mM 受试物C
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E
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5
mM
受试物A
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5
mM受试物A
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5
mM受试物A
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5
mM 受试物B
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5
mM 受试物B
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5
mM受试物B
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5
mM受试物C
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5
mM 受试物C
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5
mM 受试物C
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5
mM 受试物A
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5
mM 受试物B
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5
mM 受试物C
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F
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10 mM
受试物A
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10 mM受试物A
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10 mM受试物A
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10 mM 受试物B
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10 mM 受试物B
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10 mM受试物B
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10 mM受试物C
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10 mM 受试物C
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10 mM 受试物C
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10 mM 受试物A
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10 mM 受试物B
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10 mM 受试物C
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G
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20
mM
受试物A
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20
mM受试物A
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20
mM受试物A
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20
mM受试物B
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20
mM 受试物B
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20
mM 受试物B
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20
mM受试物C
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20
mM 受试物C
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20
mM 受试物C
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20
mM 受试物A
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20
mM 受试物B
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20
mM 受试物C
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H
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1.25 mM PC
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2.5
mM PC
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5
mM
PC
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10
mM PC
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20
mM
PC
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1.25 mM PC
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2.5
mM PC
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5
mM PC
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10
mM PC
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20
mM PC
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图2 应用板加样示例
6.3 孵育
使用多通道移液器从应用板中吸取40 μL配制好的溶液加入反应板对应孔中，用封板膜将反应板密封，200 rpm震摇5 min后，25 ℃分别孵育10
min ± 30 s、30 min ± 3 min、90
min ± 5 min、150 min ± 10 min、210
min ± 10 min、1440 min ± 15 min。
6.4 测定
孵育结束后，撕下封板膜，每孔加入新鲜配制的3 mM单溴二胺溶液40 μL。200 ～ 300 rpm震摇5 min后，用酶标仪在激发波长390 nm，发射波长480 nm下检测荧光强度。
7 数据处理
7.1 荧光值计算和校正
计算BC组、VC组的平均荧光强度和标准差，VC孔减去BC组的平均荧光强度值，各浓度受试物和阳性对照孔减去各自的对照组的荧光强度值。
计算每个测试浓度三个重复孔的平均荧光强度和标准差，采用t检验统计与VC组（12个重复）的平均多肽浓度是否有显著性差异。
7.2 多肽消耗率计算
按以下公式计算多肽消除率：
多肽消耗率（%）=[1--校正后的受试物PC孔荧光强度 / 校正后的VC组平均荧光强度] ×100%
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