7.3 反应动力学常数计算 如给定时间的最高测试浓度（受试物终浓度为5 mM）符合半胱氨酸多肽结合阳性标准，即多肽消除率≥13.89%，且与VC组差异有显著性，对该暴露时间进行进一步计算反应动力学常数。如不符合阳性标准，则受试物为非反应性。 每个时间点，以未消耗肽占比（%）的自然对数，即ln（100-dp）为纵坐标，受试物浓度为横坐标绘制反应曲线，若两者呈线性相关（相关系数r＞0.90），则得到的负斜率的绝对值即为准一级反应速率常数kobserved（mM-1），按照下式计算各时间点反应动力学常数kt（M-1s-1）： kt=kobserved·[1000/（60t）] 注：t为孵育时间，以min表示。 计算所有满足r＞0.90的孵育时间的lgkt，取其中最大值为lgkmax。 8 试验成立条件 阳性对照组90 min时间点 lgk值应在-1.75 M-1s-1 ～ -1.40 M-1s-1范围内，若90 min时间点没有得到lgk值，150 min时间点lgk应在-1.90 M-1s-1 ～ -1.45 M-1s-1范围内。 至少有5个时间点溶剂对照组变异系数（Coefficient of Variation，CV）＜15%。 9 结果判定标准 按表1对受试物进行致敏性分级。
表1 kDPRA结果判断
10 注意事项 10.1 溶剂为磷酸盐缓冲液的受试物 如果受试物溶剂为磷酸盐缓冲液，则半胱氨酸多肽贮备液配制浓度为1 mM（0.752 mg/mL），同时反应板制备时半胱氨酸多肽贮备液（或磷酸盐缓冲液）每孔加样体积减少到80 μL，然后再加入乙腈或磷酸盐缓冲液40 μL补至120 μL，使所有孔中乙腈总体积仍为40 µL。 10.2 非线性反应 出现非线性反应时无法通过斜率法求得速率常数。速率常数可以根据多肽消除率个体值按以下公式计算： k=ln[100/（100-dp）]/（E×t） 注：dp为多肽消除率（%），E为受试物的浓度，t是孵育时间。 根据该公式，计算多肽消耗率高于13.89%的阈值的每个时间点t和每个浓度E下的速率常数。将每个时间点不同浓度多肽消耗率求平均值，然后得到lgkmax值。 在发生明显多肽结合的情况下，很少会出现非线性反应。出现非线性反应须进行重复试验，以检查这种非线性反应是受试物固有的，还是试验误差所致。如果非线性结果可重复，则判定受试物存在固有的非线性反应，可采用上述公式基于个体值的计算结果进行判断。若仅在早期时间点观察到显著的肽消耗，但在随后的时间点没有观察到，也可以将早期时间点的lgkt作为结果进行致敏性分级判定。 10.3 溶解度低于20 mM的受试物 对于最大溶解浓度低于20 mM的受试物，可在较低浓度下进行试验，如出现lgkmax≥-2.0的结果，受试物可以判断为GHS 1A亚类皮肤致敏物，但对于非致敏性或lgkmax＜-2.0的结果则不能得出明确结论。此外，当得到lgkmax值在-1.93 ～ -2.06范围内，无法进行受试物致敏性分级判定，需要重新测试和/或补充额外的数据/信息进行结果判定。 10.4 特殊化合物的适用性 金属化合物可通过共价结合以外的机制与蛋白质发生反应，该方法不适用于金属化合物（如硫酸镍，Nickel sulphate）。此外，kDPRA仅测量与半胱氨酸肽的反应性，不适用于具有赖氨酸专属反应性的强致敏剂，如一些酰基卤化物、酚酯或醛类等。 有些化合物（如苯基炔丙基醛，Phenylpropionic aldehyde）不与肽共价结合，但可促进其氧化（即半胱氨酸二聚化），会引起测得多肽消耗量“增加”，可能导致假阳性结果和/或预测反应性更高。 该方法没有代谢活化系统，不能用于检测需要进行酶促反应生物活化后成为致敏剂的化学物质（如3-二甲氨基丙胺，3-Dimethylaminopropylamine）。大部分通过非生物转换后形成致敏物质的化合物（如半抗原）能够被该方法正确评价，但发生自发快速氧化的半抗原（如芳香胺、儿茶酚类或氢醌类）由于氧化停滞阶段可引起反应速率的降低，需要更多数据确定其在氧化条件下的弱反应性。 由于kDPRA采用荧光检测技术，具有自发荧光（如3,3',4',5-四氯水杨酰苯胺，Tetrachlorosalicylanilide）或荧光淬灭（如香兰素，Vanilin）的受试物可影响试验结果。此外，应注意受试物与单溴二胺的相互作用，如硫醇结构中的-SH可以与单溴二胺相互作用，导致荧光增强，因此该方法不适用于硫醇类物质，包括在试验条件下产生并释放游离-SH的物质。 |
