表2 测试菌株的回变性
注：（1）inh表示抑菌；（2）表中数值均已扣除溶剂对照回变菌落数。 7 大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备 7.1 诱导 选择SPF级雄性成年大鼠，体重200 g左右。将多氯联苯（PCB混合物）溶于玉米油中，浓度为200 mg/mL，按500 mg/kg体重一次腹腔注射，5 d后将动物实施安乐死，安乐死前禁食12 h。 也可采用苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备。经口或腹腔注射给予80 mg/kg苯巴比妥钠和80 mg/kg β-萘黄酮，每天1次，连续3 d，安乐死前禁食16 h。 7.2 S9制备 在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15 mol/L氯化钾溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15 mol/L氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15 mol/L氯化钾溶液3 mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4 ℃条件下，以9000 g离心10 min，取其上清液（S9）分装，每管装2 ～ 3 mL，储存于液氮生物容器中或-80 ℃冰箱中备用。 实验动物及动物试验环境、饲料、饮水应符合国家相应规定。上述全部操作均在冰水浴中进行，均为无菌操作。制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。 也可使用经过活力确认的商品化S9。 8 溶剂的选择 如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水/去离子水作为溶剂；如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂，首选二甲基亚砜（DMSO），也可选择其他溶剂。一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定加入量为100 μL。 9 剂量设置 需结合受试物的溶解度及对细菌的毒性，通过预试验确定各菌株的最高剂量。自发回变数的减少，背景菌变得清晰（背景菌苔减少或消失），或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒性的标志。 受试物为原料时，无细菌毒性的可溶性受试物，推荐最高剂量为5 mg/皿或5 µL/皿；无细菌毒性但5 mg/皿或5 µL/皿时不溶解的受试物，在沉淀不会干扰菌落计数的前提下，应至少包含一个不溶解剂量；低于5 mg/皿或5 µL/皿时出现细胞毒性的受试物，以最低抑菌浓度作为最高剂量。 受试物为产品时，有细菌毒性的受试物，最高剂量可为最低抑菌浓度；无细菌毒性的受试物，液体受试物最高剂量可为原液；无细菌毒性但不完全溶解的受试物，在沉淀不会干扰菌落计数的前提下，应至少包含一个不溶解剂量。 受试物应至少设5个剂量组，按等比组距的原则设定剂量间隔，推荐使用约根下10倍组距。每个剂量组做3个平行平板。 对已知和经证实含有组氨酸或色氨酸并可能影响试验结果的受试物，必要时进行预处理或采用其他合适的方法。 10 试验操作步骤 10.1 增菌培养 取营养肉汤培养基5 mL，加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37 ℃振荡（100次/min或100转/min）培养10 h。培养物的活菌浓度以1 ～ 2×109 CFU/mL为宜。 10.2 平板掺入法 试验时，将含0.5 mmol/L组氨酸－0.5 mmol/L色氨酸－0.5 mmol/L生物素溶液（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸）的顶层琼脂培养基2.0 mL分装于试管中，45 ℃水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1 mL，受试物溶液0.1 mL和磷酸盐缓冲液0.5 mL或者S9混合液0.5 mL（需代谢活化时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于37 ℃培养箱里孵育48 ～ 72 h。计数每皿回变菌落数。 试验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳性诱变剂对照和无菌对照。 10.3 预培养平板掺入法 预培养对于某些受试物可取得较好效果，因此可根据情况确定是否进行预培养。 在加入顶层琼脂培养基前，先进行以下预培养步骤：将受试物（需活化时另加S9混合液0.5 mL）和菌液37 ℃培养20 min，或30 ℃培养30 min。 然后再加入2.0 mL含0.5 mmol/L组氨酸－0.5 mmol/L色氨酸－0.5 mmol/L生物素溶液（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸）的顶层琼脂培养基。其他步骤同10.2。 11 数据处理和结果判断 记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂对照以及阳性诱变剂对照的每皿回变菌落数（如有毒性或沉淀，则需描述各浓度组细菌毒性大小和沉淀情况），并计算平均数和标准差。 11.1 如果受试物TA1535、TA1537、WP2uvrA的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的3倍或3倍以上，受试物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的2倍或2倍以上，并出现以下情形之一，则该受试物判定为致突变阳性： （1）呈剂量-反应关系； （2）任何一个剂量条件下，出现阳性反应并有可重复性。 受试物经上述5个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物细菌回复突变试验为致突变阳性。如果受试物经5个试验菌株检测后，无论加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性。 11.2 如试验中出现可疑阳性，应通过改变试验条件（如调整受试物或S9浓度，改变培养条件），对可疑阳性的受试物进行重复试验，以确保试验结果的可靠性和准确性。 11.3 阴性结果需要验证（即重复一次），应改变试验的条件（如剂量间距等）。 |
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