化妆品安全技术规范 细菌回复突变试验方法

5.10.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板

配制：琼脂和水121 ℃高压灭菌30 min后，将无菌的20%葡萄糖、V-B培养基E、组氨酸溶液和色氨酸溶液加进热的琼脂溶液中（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸馏水/去离子水改为加940 mL），混匀。冷却至大约50 ℃，在无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液，混匀，浇制平板。

5.10.3 营养琼脂平板

配制：121 ℃高压灭菌30 min后倾注平板。

6 试验菌株及其生物学特性鉴定

6.1 试验菌株

采用以下菌株作为标准组合：

鼠伤寒沙门氏菌TA1535；

鼠伤寒沙门氏菌TA97或TA97a或TA1537；

鼠伤寒沙门氏菌TA98；

鼠伤寒沙门氏菌TA100；

鼠伤寒沙门氏菌TA102或大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA（pKM101）。

6.2 生物学特性鉴定

新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。菌株鉴定的判断标准如表1所示。

表1 试验菌株鉴定的判断标准

6.2.1 组氨酸缺陷/色氨酸缺陷

原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长；色氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成色氨酸，只能在补充色氨酸的培养基上生长，而在缺乏色氨酸的培养基上，则不能生长。

鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸或者色氨酸培养基平板和无组氨酸或者色氨酸平板上划线，于37 ℃下培养24 h后观察结果。

结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生长，而在无色氨酸平板上则不能生长。

6.2.2 脂多糖屏障缺损

原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质,如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。

鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1 mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。37 ℃下培养24 h后观察结果。

结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa突变。

6.2.3 氨苄青霉素抗性

原理：含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。

鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1 mL，在氨苄青霉素平板上划线，37 ℃下培养24 h后观察结果。

结果判断：假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用，表示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。

6.2.4 紫外线敏感性

原理：具有△uvrB/A突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。

鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1 mL于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15 W，距离33 cm）8秒钟。置37 ℃下孵育24 h后观察结果。

结果判断：具有△uvrB/A突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。

6.2.5 四环素抗性

原理：具有pAQ1的菌株对四环素有抗性。

鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1 mL于四环素平板上划线，置37 ℃下孵育24 h后观察结果。

结果判断：假若测试菌照常在四环素平板上生长，表明该测试菌株对四环素有抗性，具有pAQ1质粒，否则，说明测试菌株不含pAQ1质粒。

6.2.6 自发回变

原理：每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为自发回变。这种自发回变是每种试验菌株的一项特性。

鉴定方法：将待测菌株增菌液0.1 mL加到2 mL含组氨酸-色氨酸-生物素的顶层琼脂培养基的试管内（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸），混匀后铺于底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置37 ℃培养箱中孵育48 ～ 72 h后计数每皿回变菌落数。

结果判断：每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表1要求。经体外代谢活化后的自发回变菌落数，要比直接作用下的略高。

6.2.7 回变特性-诊断性试验

原理：每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作用的性质以及S₉混合液的效应不一。

鉴定方法：按照平板掺入试验的操作步骤进行。将受试物换成诊断性诱变剂。

结果判断：标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表2。