6 观察指标 6.1 一般毒性检测 测定血液学指标和血液生化指标，试验结束测定血液学指标和血液生化指标。血液学指标测定推荐指标为白细胞计数及分类(至少分三类)、红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、血小板计数、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)等。如果对血液系统有影响，应加测网织红细胞、骨髓涂片细胞学检查。血液生化指标测定应空腹采血。测定指标应包括电解质平衡、糖、脂和蛋白质代谢、肝(细胞、胆管)肾功能等方面。至少包含丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、尿素(Urea)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、氯、钾、钠指标。必要时可检测钙、磷、尿酸(UA)、总胆汁酸(TBA)、胆碱酯酶、山梨醇脱氢酶、高铁血红蛋白、激素等指标。应根据受试物的毒作用特点或构效关系增加检测内容。 6.2 F0代动物临床观察 所有 F0代动物的健康状况至少每天观察1次，包括发病和死亡情况。除此之外，在受试物给予期和观察期应定期进行详细的临床观察(妊娠受试物给予期和哺乳受试物给予期至少分别观察2次)，每个剂量组至少观察10只妊娠和哺乳期动物。盲法观察动物，减少动物应激与观测偏倚，同项研究做到专人专项。观察记录中毒体征，体征包括：被毛、皮肤、眼球、黏膜、分泌物，以及自主神经活动变化(如流泪、毛发直立、呼吸异常如张嘴呼吸、瞳孔大小异常和排便排尿异常等)。观察记录其他体位、活动水平(如探索活动改变)和运动协调等异常反应。记录异常步态(如步态蹒跚、共济失调)、姿势(如弓形背)、对触摸或环境变化的反应、痉挛或强直性运动、抽搐、震颤、呆滞、怪异行为(如啃咬、过度梳理毛发、头部异常活动、重复转圈、自残、后退和怪叫)或攻击性行为等。记录中毒体征的起始日期、时间、程度和持续时间。 在临近分娩或分娩当日以及断乳(PND21)时应记录 F0代动物体重。在妊娠期和哺乳期，记录每周的饲料消耗量。通过饮水受试物给予的 F0代动物每周记录饮水量。记录 F0代动物体重变化，染毒期每周至少记录体重1次，经灌胃给予时实验动物每周至少称重2次。 6.3 F1代动物临床观察 6.3.1 F1代动物临床观察要求 所有 F1代动物的健康状况至少每天观察1次，包括发病和死亡情况。在受试物给予期和观察期，应对 F1代动物进行详细的临床观察，观察及记录要求同6.2。 6.3.2 F1代动物体格发育指标 根据表4记录体重，观察发育指标变化。根据预期效果和前期测量结果，可在其他发育期多次测量F1代动物体格发育指标。断乳后2d内不做测试，相关指标可提前检测。 表 4 体格发育和神经行为检测频率和时间点
记录 F1代动物存活数量，根据肛门与生殖器间距区分性别，F1代动物于出生后逐一称量体重，以阴道开放或包皮分离情况评估性成熟，确定周龄并记录体重。 6.3.3 F1代动物个体行为发育 F1代动物发育至断乳前(PND<21)每窝每性别至少选取1只动物进行个体行为发育测试，测试始终使用同一只 F1代动物，不同指标的测试间隔时间一致。评价个体行为发育的方法包括：平面翻正反射、负趋地性和自主行为。 6.3.4 F1代动物运动能力 断乳前和初成年期(PND60~70)对F1代动物进行运动能力观察。断乳时运动能力试验原则参见6.3.1第一段。始终使用同一只 F1代动物评价个体运动能力发育。可在3个或更多时间段(如 PND13、PND17和 PND21)对F1代动物进行测试，以全面评价F1代动物运动能力。在初成年期试验结束前，选择同一只或同窝动物测试运动能力，必要时增加测试天数。选择能准确检测动物活动情况的自主活动记录仪。减少周围环境对动物的干扰，能够干扰行为测试(包括运动能力)的因素包括：噪声、温度、笼具大小和形状、相对湿度、光线、气味、饲养笼和测试笼的使用，以及环境对注意力的干扰。 6.3.5 F1代动物运动和感觉功能 F1代动物在青春期和初成年期至少分别进行1次运动和感觉功能测试。断乳时运动和感觉功能试验原则参见6.3.1第一段。根据所选择方案(表1或表2或表3)对样本量的要求测试感觉功能(躯体感觉和前庭功能)和运动功能(力量和协调性)。运动与感觉测试方法包括：后肢撑力、翻正反射、听觉惊吓反应。要以足够的样本量进行充分的感觉功能(躯体感觉和前庭功能)和运动功能(力量和协调性)测试。 6.3.6 F1代动物学习和记忆测试 F1代动物在青春期(PND22~30)和初成年期开展学习和记忆测试。断乳时学习和记忆测试原则参见6.3.1第一段。这两个发育时期的测试方法可以相同也可以不同。测试设计应符合以下两个准则：第一，在多个阶段，选择可多次重复测量的方法，能够反映出学习和记忆能力的提高，第二，试验应包含对大鼠记忆(短期或长期)能力测试，学习和记忆能力测试要联合进行。必要时可考虑附加试验，以排除基于动物感觉、动机和运动能力变化所引起的干扰。除上述两准则外，可参考同类受试物学习和记忆测试的试验方法。符合上述两项准则的试验包括：避暗试验、Morris水迷宫、跳台试验、穿梭箱试验(双向回避试验)等。
7 病理学检查 7.1 大体解剖 F1代动物断乳后，处死 F0代动物，并进行大体解剖和脏器系数的检测。评估 PND11~22F1代动物的神经病理学。试验结束时(PND60~70)，评估动物的中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)组织病理学。PND22及以下的 F1代动物经灌注固定后取材，或处死动物后取材浸泡固定。试验结束时，F1代(PND60~70)经灌注固定后取材。采取均衡设计原则准备动物组织样本(如对动物进行灌注固定、大体解剖、标本处理以及染色等)，保证每个批次的操作都含有来自各个剂量组的代表性样品。 7.2 F1代动物组织样本处理 组织样本需包括神经系统主要区域。取材过程遵从病理学取材标准，组织标本浸泡于固定液中，标本固定时长要一致。石蜡包埋是 CNS和 PNS组织包埋的最常见方法。使用适当的包埋技术(如当外周神经组织有可疑病变需要进行形态学分析时)使样本在高分辨率镜下观察更清晰。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
