包虫病诊断标准

附录C

(规范性附录)

免疫学诊断方法

人体包虫病免疫学诊断方法有间接红细胞凝集试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PVC薄膜快速ELISA等。其中，以ELISA法最为常用且较敏感。现有的包虫病免疫学试验方法在敏感性和特异性上存在很大的差异。试验结果受许多因素的影响:抗原的性质和质量;检测用的试验系统;棘球蚴囊的数量、部位和活力;不同地理虫株差异:个体免疫应答反应的差异等。约10%~40%的手术确诊的包虫病患者用目前已知的抗原检测不到特异性抗体。本规范中列出了国内外普遍应用的一些方法。

C.1 抗原制备

C.1.1 囊液粗抗原：完整的棘球蚴组织表面清洗干净消毒后，无菌抽取囊液(宜使用无化脓和无钙化的可育囊)。将囊液经5.000/min离心20min，上清液冻存备用。

C.1.2 纯化抗原

可用磷钨酸、氯化锈沉淀法对棘球蚴囊液抗原进行部分纯化。取20ml离心后的囊液上清，加人2mol/L MgCl₂ 和4%磷钨酸(用NaOH调节pH至7.5~7.6)各1.2ml:室温搅拌 5min，5 000r/min离心30min;将沉淀用0.02mol/L.pH7.2 PBS溶解:4°C透析24小时，测定蛋白浓度，-20°C冻存。

C.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)

C.2.1 抗原

囊液粗抗原、纯化抗原、特异性抗原。

C2.2 操作方法

C2.2.1 0.05mol/L.pH9.6碳酸缓冲液稀释抗原至工作浓度，每孔加人100μl，置湿盒4°C过夜。次日，倾去抗原，用含0.05%吐温-20 的磷酸盐缓冲液(0.02mol/L.pH7.4 PBST)洗涤3次，每次3min，拍干；

C.2.2.2 加待检血清:血清用含3%BSA的PBST1:200稀释，每孔加入1001l，每板应设参考阳性一孔，参考阴性三孔及PRS对照一孔。置湿盒，37°C1h，取出倾去血清，同前洗涤3次;

C.2.2.3 加酶标记第二抗体:加入工作浓度的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG100μl，37°C，1h，倾去第二抗体，同前洗涤;

C.2.2.4 加底物显色:加邻苯二PE橙红色)或四甲基胺/四甲基联苯胺硫酸盐(TMB/TMBS，蓝色)底物溶液100ul，37°C，30min;

C.2.2.5 加终止液:2mol/L H，SO， 50ulC.2.3 结果判断

在酶标仪上读取492nm(OPD)或450nm(TMB/TMBS)吸光值，以待测样本(S)对阴性对照血(N)的S/N≥2.1为阳性临界值。

C.3 间接红细胞凝集试验(IHA)

C.3.1 红细胞醛化

C.3.1.1 从绵羊颈静脉无菌采血100ml，加人200~400ml阿氏液(400ml三蒸水中溶解葡萄糖8.2gNaCl 1.68g、柠檬酸三钠2.4g和柠檬酸0.22g，调pH至6.1，高压或过滤除菌)中，混匀抗。3 000rmin离心15min，弃上清;

C.3.1.2 用生理盐水洗涤红细胞3次，同上离心。沉淀中加人50ml生理盐水和100ml PBS(0. 15mol/L，pH8.0)混匀;

C.3.1.3 加人经10% Na₂CO₂，中和的戊二醛300ml(10% Na2CO275ml 与25%戊二醛225ml混合)磁力搅拌器4°C缓慢搅拌24h;

C.3.1.4 离心弃上清，沉淀用生理盐水洗涤5次。最后，将红细胞沉淀用含0.1%NaN₃的生理盐水配成10%细胞悬液，4°C保存。

C.3.2 红细胞致敏

C.3.2.1 将10%戊二醛醛化的绵羊红细胞20ml用生理盐水300ml洗3次(3000r/min，5min)，红细胞压积约为2ml;

C.3.2.2 加人生理盐水98ml，将红细胞配成2%悬液100ml;

C.3.2.3 与1:10 000鞣酸100ml混合于37°C水浴30min，每10min混旋一次;

C.3.2.4同C.3.2.1离心洗3次，弃上清;

C.3.2.5沉淀加人生理盐水198ml，将鞣化红细胞配成1%悬液200ml;

C.3.2.6与稀释好的囊液抗原200ml混合，37°C水浴30mnin，每10min混旋一次;

C.3.2.7 离心弃上清，用1%兔血清 PBS(0.15mol/L pH7.2 PBS)洗3次，弃上清;

C.3.2.8 用10%兔血清PBS 18ml将红细胞配成10%致敏红细胞20ml。置4°C冰箱保存。

C.3.3 操作方法

C.3.3.1 准备抗原:用0.15mol/L.pH7.2 PBBS将10%致敏红细胞保存液稀释至1%备用;

C.3.3.2 血凝板每孔加人25pl PBS;

C.3.3.3 第一孔加入待检血清25pl，用移液器或稀释棒从第一孔开始逐孔向后稀释;

C.3.3.4每孔加1%致敏红细胞25ppl.振荡混合3min，置37°C反应1h，判定结果;

C3.3.5 对照设置:每批试验均应设置阳性、阴性和红细胞对照(红细胞对照孔只有PB3S和致敏红细胞)。

C.3.4 结果判断

C.3.4.1阴性反应:红细胞全部沉人孔底呈点状，边缘光滑;

C.3.4.2阳性反应: ++++100%红细胞凝集; +++75%红细胞凝集; ++50%红细胞凝集;+25%红细胞凝集。

以血清1:128稀释出现阳性反应者(十十)判为血清抗体阳性。

C.4  PVC薄膜快速ELISA

C.4.1 抗原

囊液粗抗原、纯化抗原、特异性抗原。

C.4.2 操作方法

C.4.2.1 取已包被好抗原的 PVC薄膜软板，编号，用 PBST洗1次，然后每孔加 PBST 200pl:C.4.2.2 加待检血清及参考血清(每板作阴性对照一孔、阳性对照一孔)每孔10p1，混匀，置湿盒37°C5min(或25°C室温10min)。倾去血清，用PBST连续洗8次，甩干;C4.2.3 加酶标抗体:每孔加工作浓度酶标抗体200l，37°C 5min，同上洗涤8次，再加蒸馏水洗一次，甩干;

C.4.2.4 加底物显色:每孔加 TMB底物200pl，反应5min~10min(TMB底物溶液的制备:TMB50mg溶于10ml二甲基亚砜中作为母液，4°C保存。用前取母液1ml十pH5.0柠檬酸缓冲液50ml十30% H2O2 8pl.

C.4.3 结果判断

参照阴性及阳性对照，用目视法判断结果。阴性基本无色，阳性为鲜蓝色。