包虫病诊断标准

C.5免疫印迹技术(Western blot， WB)

C.5.1 抗原膜制备

囊液粗抗原、原头节粗抗原或特异性纯化抗原进行常规SDS-PAGE凝胶电泳，分离胶浓度为15%，抗原蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，再转移到硝酸纤维膜上。经Ponceau S染色，标记标准分子量位置。将抗原膜用封闭液(3%脱脂奶粉，0.15mol/L NaCL.0.05mol/L Tris-HCl，pH 7.4.0.02%吐温一20)封闭1h后将膜裁成宽2~3mm的膜条备用。此抗原膜条，可夹在PBS湿滤纸中封于塑料袋内，4°C保存备用。若置低温冰箱中，可长期保存。

C.5.2 操作方法

C.5.2.1 将抗原膜置于反应槽中，加人用封闭液(3%脱脂奶粉，0.15mol/1NaCL，0.05mol/1.TrisHCI，pH7.4.0.02%吐温一20)1:100稀释的待检血清，每批试验应设参考阻性、阴性和PBS对照。室温振摇2h(4°C可过夜)。次日，用上述封闭液洗4次，每次5min;

C.5.2.2 加入工作浓度的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人1gG，室温2h，同前洗涤;

C.5.2.3 加入二氨基联苯胺(DAB，棕色)显色至清晰后，蒸馏水终止反应，将反应膜干燥保存。

C.5.3 判读结果

细粒棘球蚴特异性反应条带:8kDa、16kDa，20-24kDa(AgB)利138kDa(Ag5)

多房棘球蚴特异性反应条带:18kDa(Em18)，54kDa(Em2)和220kDa(EmAP)

C.6 循环抗原检测(cireulating antigen，cAg)

C.6.1 特异性单克隆或多克隆抗体的制备

C.6.1.1 用粗抗原或特异性抗原免疫Balb/c小鼠，按常规方法进行细胞融合、阳性细胞克隆筛选和鉴定，将分泌特异性单克隆抗体的细胞株腹腔注射小鼠，获得单克隆抗体腹水;

C.6.1.2 用粗抗原或特异性抗原免疫兔，获得高效价的多克隆抗体;

C.6.1.3 建立可检测粗抗原或特异性抗原的敏感的双抗体夹心EL1SA方法;

C.6.1.4 用建立的双抗体夹心ELISA反应系统检测病人血清中的cAg。

C.6.2 循环抗原检测

C.6.2.1 将特异性单克隆抗体或多克隆抗体用0.05mol/L.pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度包被酶标板，每孔100pl，4°C过夜后用PBST洗板3次;

C.6.2.2 每孔加入含3% BSA的 PBST 100ul，于37°C封闭1h，洗板3次;

C.6.2.3 待检血清用上液1:2稀释，每孔加100pl，37°C温育1h，洗板3次;

C.6.2.4 加工作浓度的酶标记第二抗体(特异性单抗或多抗)100pl37°C1h后，洗板3次;

C.6.2.5 加邻苯二胺(OPD，橙红色)或四甲基胺/四甲基联苯胺硫酸盐(TMB/TMBS，蓝色)底物溶液100l，37°C，30min；

C.6.2.6 加人50pl 2mol/LH2SO1，终止反应;

C.6.2.7 酶标仪测各孔吸光值;

C.6.2.8 对照设置和结果判定:每板设阳性对照一孔(1yg/ml抗原100pl).阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值十3SD或S/N≥2.0为阳性临界值。

C.7 循环免疫复合物检测(circulating immune complex，CIC)

C.7.1 检测CIC中的循环抗原C.7.1.1 用0.01mol/LpH8.4硼酸盐缓冲液将PEG6000配成7%溶液，取此液100rl加等量1:2待检血清混合置室温下1h后，5000r/min离心1h;

C.7.1.2 吸去上清液,在沉淀中加含有8mol/L尿素的0.05mol/L.pH9.6碳酸盐缓冲液0.5ml,溶解沉淀物;

C.7.1.3用此液包被酶标板每孔100pl,每份标本包被两孔，4°C过夜后，洗板3次(阳性及阴性对照同样处理);

C.7.1.4每孔加含有3%BSA的PBST100pl,37°C封闭1h,洗板3次;

C.7.1.5加人HRP标记的工作浓度特异性单抗或多抗100l,37°C下1h后洗板3次;

C.7.1.6 加邻苯二胺(OPD.橙红色)或四甲基胺/四甲基联苯胺硫酸盐(TMB/TMBS,蓝色)底物溶液100pl,37°C,30min。

C.7.1.7 加人2mol/LH,SO,50l终止反应;

C.7.1.8 酶标仪测各孔吸光值;

C.7.1.9 对照设置和结果判定:每板设阳性对照一孔(1yg/ml抗原100pl),阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值十3SD为阳性临界值。

C.7.2 检测CIC

C.7.2.1 特异性抗体的制备同C.6.1；

C.7.2.2 将特异性单克隆抗体或多克隆抗体用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度包被酶标板，每孔100l，4°过夜后用PBST洗板3次;

C.7.2.3 每孔加人含3%BSA的PBST 100pl.于37°C封闭1h,洗板3次;

C.7.2.4 待检血清用上液1:20稀释，每孔加100pl.37°C温育1h,洗板3次;

C.7.2.5加工作浓度的酶标记抗人IgG或IgM100ul 37°C1h后，洗板3次;

C.7.2.6加邻苯OPD,橙红色)或四甲基胺/四甲基联苯胺硫酸盐(TMB/TMIS，蓝色)底物溶液100pl,37°C.30min；

C.7.2.7 加人2ma/H2SO;501终止反应;

C.7.2.8 酶标仪测各孔吸光值;

C.7.2.9 对照设置和结果判定:每板设阳性对照一孔(人工复合物),阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值+3SD或S/≥2.0为阳性临界值。