附 录
D （资料性） 实验室检查 D.1 布氏锥虫抗体检测 D.1.1 方法 采用胶体金免疫层析试纸条法，检测人血清、血浆或全血样品中的布氏锥虫特异性抗体。 D.1.2 试剂组成 布氏锥虫抗体检测试剂盒。 D.1.3 操作步骤 按试剂盒产品说明书要求操作并在规定时间内判读结果。 D.1.4 结果判读 质控区和检测区同时出现色带为检测阳性；若仅在质控区出现色带为阴性；质控区无色带显示，则此检验无效。 D.2 病原学检测 D.2.1 血涂片镜检 取血在载玻片上涂制薄血膜，用吉氏染色后镜检，查见锥鞭毛体判定为阳性。通常罗得西亚锥虫病患者的虫血症远比冈比亚锥虫病的高，因此，在罗得西亚锥虫病患者外周血中更容易查见锥鞭毛体。对冈比亚锥虫病患者可通过血液浓缩或反复多次检查以排除或确诊。 D.2.2 淋巴液涂片镜检 直接涂片或用生理盐水稀释10倍离心后取沉淀涂片，并用吉氏染色后镜检，查见锥鞭毛体判定为阳性。 D.2.3 下疳抽吸液涂片镜检 直接涂片或用生理盐水稀释10倍离心后取沉淀涂片，并用吉氏染色后镜检，查见锥鞭毛体判定为阳性。 D.2.4 骨髓穿刺液涂片镜检 取骨髓穿刺液制成骨髓涂片，用吉氏染色后镜检，查见锥鞭毛体判定为阳性。 D.2.5 脑脊液涂片镜检 取脑脊液离心后取沉淀涂片，并用吉氏染色后镜检，查见锥鞭毛体判定为阳性。 D.3 布氏锥虫核酸检测 D.3.1 样本处理 用核酸提取试剂盒或其它基因组DNA提取方法提取待检者血液、淋巴液、下疳抽吸液、骨髓穿刺液或脑脊液样本全基因组DNA。 D.3.2 试剂组成 基因组DNA提取试剂盒和PCR扩增试剂盒。 D.3.3 操作步骤和结果判读 D.3.3.1 引物序列 采用普通PCR方法从待检者血液、淋巴液、下疳抽吸液、骨髓穿刺液或脑脊液中检测布氏锥虫特异性基因片段。引物序列如下：
D.3.3.2 布氏锥虫特异性核酸的扩增 以引物PLC657和PLC658进行PCR扩增，反应体系为50 μL： Taq酶（5 U/μL）
0.25 μL 10×buffer（含15 mmol/L
Mg2+） 5 μL dNTP（25 mmol/L） 4 μL PLC657（20 μmol/L）
1.5 μL PLC658（20 μmol/L）
1.5 μL DNA模板 2μL ddH2O 35.75 μL PCR过程： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s 共40个循环；72 ℃ 7 min。 将PCR产物进行电泳，确认片段大小约为326 bp的特异片段。测序并通过序列同源性比对（BLAST）分析，以确定布氏锥虫核酸检测是否为阳性。 D.3.3.3 布氏锥虫冈比亚亚种特异性核酸的扩增 以引物TgsGP1和TgsGP2进行PCR扩增，反应体系为50 μL： Taq酶（5 U/μL） 0.25 μL 10×buffer（含15 mmol/L
Mg2+） 5μL dNTP（25 mmol/L） 4 μL TgsGP1（20 μmol/L）
1.5 μL TgsGP2（20 μmol/L）
1.5 μL DNA模板 2μL ddH2O 35.75 μL PCR过程： 95 ℃ 15 min；95 ℃ 60 s，63 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s 共45个循环；72 ℃ 10 min。 将PCR产物进行电泳，确认片段大小约为308 bp的目标片段。测序并通过序列同源性比对（BLAST）分析，以确定布氏锥虫冈比亚亚种核酸检测是否为阳性。 D.3.3.4 布氏锥虫罗得西亚亚种特异性核酸的扩增 以引物SRA-F1和SRA-R1进行PCR扩增，反应体系为50 μL： Taq酶（5 U/μL）
0.25 μL 10×buffer（含15 mmol/L
Mg2+） 5μL dNTP（25 mmol/L） 4μL SRA-F1（20 μmol/L）
1.5μL SRA-R1（20 μmol/L）
1.5μL DNA模板 2μL ddH2O 35.75 μL PCR过程为： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s 共40个循环；72 ℃ 7 min。 将PCR产物进行电泳，确认片段大小约为288 bp的目标片段。测序并通过序列同源性比对（BLAST）分析，以确定布氏锥虫罗得西亚亚种核酸检测是否为阳性。 |
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