脊髓灰质炎野病毒和疫苗衍生病毒鉴定技术（WS/T 10058—2026 ）

4 缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BSL-2：生物安全防护水平二级（Biosafety level-2）

CPE：致细胞病变效应（Cytopathic effect）

EV：肠道病毒（Enterovirus）

ITD：型内鉴定（Intratypic differentiation）

L20B：表达人类脊髓灰质炎病毒受体的小鼠L细胞系（Mouse L cells expressing the human poliovirus receptor）

NEV：非肠道病毒（Non enterovirus）

NPEV：非脊髓灰质炎肠道病毒（Non-polio enterovirus）

NSL：非脊髓灰质炎疫苗类似株（Non Sabin like）

PV：脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）

PVn：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型脊髓灰质炎病毒

RD：人横纹肌肉瘤细胞系（Rhabdomyosarcoma）

SL：脊髓灰质炎疫苗类似株（Sabin like）

SLn：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型脊髓灰质炎疫苗类似株

VDPV：疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（Vaccine derived poliovirus）

VDPVn：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型疫苗衍生脊髓灰质炎病毒

WPV：脊髓灰质炎野病毒（Wild poliovirus）

WPVn：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型脊髓灰质炎野病毒

5 WPV 和 VDPV 鉴定流程

5.1 WPV 和 VDPV 鉴定流程图

粪便标本是脊髓灰质炎病毒鉴定最常用的标本类型，本文件以粪便标本为例说明WPV和VDPV鉴定流程，其他类型的标本可参照执行。粪便标本的WPV和VDPV鉴定流程如图1所示。

5.2 实验室生物安全

根据《人间传染的病原微生物目录》（国卫科教发〔2023〕24 号）规定，鉴定流程中的所有操作应在 BSL-2 实验室进行。经此流程鉴定出的脊髓灰质炎野病毒和Ⅱ型脊髓灰质炎病毒的病毒分离物操作应在 BSL-3 条件下进行，Ⅰ型和Ⅲ型脊髓灰质炎疫苗株和 VDPV 的病毒分离物应在 BSL-2 条件下进行。实验室生物安全要求应符合 GB 19489 和 WS 233 的规定。

图 1 WPV 和 VDPV 鉴定流程图 

6 WPV 和 VDPV 鉴定步骤

6.1 标本的采集和运输

采集粪便标本用于脊髓灰质炎病毒分离，每份标本质量大于或等于5 g（约为成人的大拇指末节大小），装入一次性采便管或采便盒中。根据WS/T 852和《人间传染的病原微生物目录》的规定，应按照UN 3373（B类感染性物质）的要求，采用B类包装对标本进行冷藏运输。

6.2 标本的处理

粪便标本在进行病毒分离之前应进行处理，具体操作按附录A。

6.3 病毒分离

处理后的粪便悬液应同时接种到L20B和RD两种细胞系上。病毒分离具体操作及L20B和RD两种细胞系的检测按WS 294的规定。

6.4 ITD 筛选

ITD包括前后两个rRT-PCR实验，分别为ITD rRT-PCR和VDPV rRT-PCR。首先对L20B阳性分离物进行ITD rRT-PCR，鉴定脊髓灰质炎病毒和其血清型别，同时筛选疑似的WPV。随后进行VDPV rRT-PCR，筛选疑似的VDPV。ITD的具体操作按附录B。

6.5 VP1 区核苷酸序列测定

对ITD筛选到的疑似WPV或VDPV进行完整的VP1区（Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型脊髓灰质炎病毒VP1区域长度分别为906nt、903nt和900nt）核苷酸序列测定，该方法是鉴定WPV和VDPV的金标准方法。根据WS 294规定，粪便标本进行病毒分离时，传代次数≤5次，随即进行VP1区核苷酸序列测定，防止病毒在扩增过程中产生随机突变位点。对单一血清型的脊髓灰质炎病毒VP1区核苷酸序列测定的具体操作按附录C。

6.6 序列比对鉴定 WPV 和 VDPV

采用生物信息学软件对比样品与Sabin株的VP1区核苷酸序列，按照下述标准鉴定WPV、VDPV和SL。

——属于血清型Ⅰ型且与 Sabin1 的核苷酸变异率≥15 %（≥136 个 nt 差异）的脊髓灰质炎病毒为WPV1。

——属于血清型Ⅰ型且与 Sabin1 的核苷酸变异率＞1 %（≥10 个 nt 差异）且＜15 %（≤135 个 nt差异）的脊髓灰质炎病毒为 VDPV1。

——属于血清型Ⅰ型且与 Sabin1 的核苷酸变异率≤1 %（≤9 个 nt 差异）的脊髓灰质炎病毒为 SL1。

——属于血清型Ⅱ型且与 Sabin2 的核苷酸变异率≥15 %（≥136 个 nt 差异）的脊髓灰质炎病毒为WPV2。

——属于血清型Ⅱ型且与 Sabin2 的核苷酸变异率＞0.6 %（≥6 个 nt 差异）且＜15 %（≤135 个 nt差异）的脊髓灰质炎病毒为 VDPV2。

——属于血清型Ⅱ型且与 Sabin2 的核苷酸变异率≤0.6 %（≤5 个 nt 差异）的脊髓灰质炎病毒为 SL2。

——属于血清型Ⅲ型且与 Sabin3 的核苷酸变异率≥15 %（≥135 个 nt 差异）的脊髓灰质炎病毒为WPV3。

——属于血清型Ⅲ型且与 Sabin3 的核苷酸变异率＞1 %（≥10 个 nt 差异）且＜15 %（＜135 个 nt差异）的脊髓灰质炎病毒为 VDPV3。

——属于血清型Ⅲ型且与 Sabin3 的核苷酸变异率≤1 %（≤9 个 nt 差异）的脊髓灰质炎病毒为 SL3。