脊髓灰质炎野病毒和疫苗衍生病毒鉴定技术（WS/T 10058—2026 ）

附 录 A

（规范性）

粪便标本处理标准操作流程

A.1 实验材料

A.1.1 50 mL耐氯仿离心管。

A.1.2 1 mL或5 mL吸氯仿用的玻璃吸管。

A.1.3 5 mL和10 mL吸管。

A.1.4 外螺旋盖的冻存管（5 mL）。

A.1.5 直径大约3 mm的玻璃珠。

A.1.6 含有抗生素的PBS（+）（配制见A.4）。

A.1.7 氯仿。

A.2 实验步骤

A.2.1 在离心管上标记标本号。

A.2.2 每管中加入10 mL PBS（+）、1 g玻璃珠、1 mL氯仿。

A.2.3 在生物安全柜中将每一份粪便标本取约2 g加入标记好的离心管中。

A.2.4 确保拧紧离心管，用机械振荡器剧烈振荡20min。

A.2.5 在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机4 ℃ 1500 g离心20min。

A.2.6 在生物安全柜中将每一份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理一次）。

A.2.7 一管粪便悬液冻存于-20 ℃作为备份，另一管置于2 ℃～8 ℃用于病毒分离。

A.3 粪便标本和悬液的保存

收到粪便标本后，应尽快进行处理，使粪便悬液及时接种到细胞上。如果粪便悬液能在48 h内接种细胞，可置于2 ℃～8 ℃冷藏。如果超过48 h，应冻存于-20 ℃。如需进行长时间保存应冻存于-80 ℃。原始粪便标本至少保存6个月，粪便悬液至少保存3个月。

A.4 含有抗生素的 PBS（+）的配制

A.4.1 PBS（+）的配制（磷酸盐缓冲液，pH 7.2～7.4）

A.4.1.1 A液

NaCl               8.00g

KCl                0.20g

Na₂HPO₄(无水)           0.91g

KH₂PO₄              0.12g

用600 mL～800 mL蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000 mL，10 psi (70 kPa) 15min高压灭菌。

注：所用实验材料（NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4）应为优级纯，蒸馏水的电导率应在50万欧姆以上。

A.4.1.2 B 液

MgCl₂•6H₂O         0.10g

溶解于100 mL蒸馏水中，10 psi (70 kPa) 15min高压灭菌。

注：所用实验材料（MgCl₂•6H₂O）应为优级纯，蒸馏水的电导率应在50万欧姆以上。

A.4.1.3 C液

CaCl₂            0.10g

溶解于100 mL蒸馏水中，10 psi (70 kPa) 15min高压灭菌。

取1份B液和1份C液加到8份A液中即可配制成PBS（+）。

注：所用实验材料（CaCl2）应为优级纯，蒸馏水的电导率应在50万欧姆以上。

A.4.2 含有抗生素的PBS（+）配制

将1×10⁶单位的结晶青霉素和1 g硫酸链霉素溶解于100 mL无菌的PBS（+）中，分装成5 mL每管冻存于-20 ℃。使用时，取5mL母液加到500 mL完全PBS中，使青霉素、链霉素最终含量分别为100单位/mL和100μg/mL，2 ℃～8 ℃可保存一周。