脊髓灰质炎野病毒和疫苗衍生病毒鉴定技术（WS/T 10058—2026 ）

附 录 C

（规范性）

脊髓灰质炎病毒 VP1 区核苷酸序列测定标准操作流程

C.1 VP1 区核苷酸序列测定操作流程

脊髓灰质炎病毒VP1区核苷酸序列测定是鉴定WPV和VDPV的金标准，具体操作流程见图C.1。

图 C.1 脊髓灰质炎病毒 VP1 区核苷酸序列测定流程图

C.2 RNA 提取

C.2.1 实验材料

商品化RNA提取试剂盒。

C.2.2 实验步骤

C.2.2.1 L20B 阳性分离物冻融两次，在 13000 g 的条件下离心 1min，收集上清液，移至不含 RNA 酶的离心管中。

C.2.2.2 使用商品化的试剂盒或自动核酸提取仪提取上清液中的 RNA，操作方法参照试剂盒说明书或自动核酸提取仪使用说明。

C.3 RT-PCR 扩增

C.3.1 实验材料

C.3.1.1 商品化 RT-PCR 反应试剂盒。

C.3.1.2 阳性对照：脊髓灰质炎病毒 RNA。

C.3.1.3 阴性对照：无 RNA 酶的去离子水。

C.3.1.4 RT-PCR 引物参见表 C.1

C.3.2 实验步骤

C.3.2.1 配制反应体系

不同的商品化RT-PCR反应试剂盒配制体系不同，具体操作按照试剂盒的说明书进行。以一般通用方法为例，参见表C.2。

C.3.2.2 加样

取5μL提取的阳性分离物RNA （或5μL阳性对照或5μL阴性对照） 加入上述配制的反应体系中。

C.3.2.3 设置反应程序

设置反应程序如下：50 ℃反应30min；94 ℃预变性2min；扩增反应94 ℃30s，50 ℃30s，72 ℃1min20s，共40个循环；72 ℃7min；4 ℃保持。不同的荧光定量PCR仪扩增的程序会有一些差异，可根据所使用的仪器对反应程序进行适当调整。

C.3.3 凝胶电泳

使用含有GelRed或其他荧光染料的琼脂糖凝胶对3 μL~5 μL PCR产物进行电泳，在凝胶成像仪中观察并记录结果。将PCR产物的剩余部分置于冰上或4 ℃，用于下一步PCR产物的纯化。

C.4 PCR 产物纯化

C.4.1 纯化方法选择原则

PCR产物根据电泳结果，选择直接纯化或者切胶纯化。如果电泳结果只有一个1.1 kb的目的条带，可采用直接纯化。如果凝胶电泳结果除了1.1 kb的目的片段外还有其他非特异的条带，应采用切胶纯化。

C.4.2 直接纯化

C.4.2.1 实验材料

商品化的PCR产物纯化试剂盒。

C.4.2.2 实验步骤

按照商品化的PCR产物纯化试剂盒说明书，对保存在4 ℃的剩余PCR产物进行纯化，去除产物中的引物、核苷酸、聚合酶和盐。选择任何商品化试剂盒都应提供大于90 %的DNA回收率。用纯化后的PCR产物作为模板进行下一步的标记反应。

C.4.3 切胶纯化

C.4.3.1 实验仪器和材料

C.4.3.1.1 电泳仪。

C.4.3.1.2 微波炉。

C.4.3.1.3 手术刀。

C.4.3.1.4 紫外透射仪。

C.4.3.1.5 防紫外线护目镜或面罩。

C.4.3.1.6 琼脂糖凝胶。

C.4.3.1.7 GelRed。

C.4.3.1.8 商品化的切胶回收 PCR 产物纯化试剂盒。

C.4.3.2 实验步骤

C.4.3.2.1 将约 50 μL 的 PCR 产物加入 1 cm 厚的 1.7%琼脂糖凝胶中，然后电泳 30min。

C.4.3.2.2 将凝胶放入 GelRed 溶液中染色约 20min。

C.4.3.2.3 在紫外透射仪上将 PCR 产物所在的琼脂糖凝胶块用手术刀小心割下，放入新的 1.5 mL 的离心管中。

C.4.3.2.4 称取切下来的琼脂糖凝胶块的质量，按照商品化的切胶回收 PCR 产物纯化试剂盒说明书进行 PCR 产物的纯化。用纯化后的 PCR 产物作为模板进行下一步的标记反应。