脊髓灰质炎野病毒和疫苗衍生病毒鉴定技术（WS/T 10058—2026 ）

C.5 测序标记反应

C.5.1 实验材料

C.5.1.1 商品化的标记反应试剂盒。

C.5.1.2 标记反应引物，见表 C.3。

C.5.2 实验步骤

C.5.2.1 配制反应体系

每个纯化过的PCR产物作为DNA模板进行4条引物标记，测序标记反应体系见表C.4。

C.5.2.2 设置反应程序

设置反应程序如下：96 ℃预变性1min；扩增反应：94 ℃10s，50 ℃5s， 60 ℃ 4min，共25个循环；4℃保持。不同的荧光定量PCR仪扩增的程序会有一些差异，可根据所使用的仪器对反应程序进行适当调整。

C.6 纯化标记反应产物

C.6.1 原理

离心柱式方法纯化标记反应产物的原理是离心柱内的凝胶保留了多余的标记试剂、dNTPs和不需要的盐，允许荧光标记的PCR产物流过。

C.6.2 实验仪器和材料

C.6.2.1 微量离心机。

C.6.2.2 葡聚糖 Sephadex G-50 粉末。

C.6.2.3 离心柱。

C.6.3 实验步骤

C.6.3.1 电子秤称量 2.7 g Sephadex G-50 粉末，置于 50 mL 离心管中，加去离子水至 50 mL 后充分混匀，静置 30min。

C.6.3.2 用移液器将混匀的 Sephadex G-50 混悬液 900 μL 加入离心柱中，静置 10min。

C.6.3.3 加压或离心，使多余的液体从离心柱的底部流出。

C.6.3.4 将离心柱放在 2 mL 收集管上，于室温下 3000 r/min，离心 2min。

C.6.3.5 弃掉收集管，将离心柱放在 1.5 mL 无菌离心管上，向凝胶的斜面中央加入 20 μL 标记产物，3000 r/min 离心 2min，1.5 mL 离心管中的液体即为纯化后的标记产物。

C.7 测序仪上样

根据DNA自动测序仪的使用说明，将纯化后的标记反应产物上样到测序仪中进行序列测定。

C.8 编辑原始序列

C.8.1 检查原始峰图质量

C.8.1.1 合格的原始峰图

合格的原始峰图应具有峰形尖锐、基线平稳、无重叠峰和背景噪声小的特点。

C.8.1.2 不合格的原始峰图

如果原始峰图出现了多个重叠的信号峰，或显著的拖尾现象（峰宽度延长）则为不合格的峰图。

C.8.2 修剪序列

原始峰图的5´端和3´端分别为上游和下游引物的位置，若出现混杂的碱基或存在较高的背景噪声，应将其剪切掉。

C.8.3 组装序列

将剪切后的Y7、PV1A、PV4S和Q8序列利用末端重叠的方法组装成一条完整序列。合格的组装指重叠部分碱基匹配度不低于85%，并且重叠部分长度应不少于20个碱基对。同时，无论上游还是下游引物扩增的序列应均能覆盖整个VP1区域，即每个碱基位置至少有一条上游和一条下游引物的序列进行校对。

C.8.4 校对碱基并输出共有序列

序列组装后应对序列之间重叠区域不一致的碱基进行校对，以确保不同序列同一位置碱基对的一致性。

C.8.5 修剪序列长度

将输出的共有序列与参考株Sabin1 VP1（GenBank No.AY184219）、Sabin2 VP1（GenBank No.AY184220）或Sabin3 VP1（GenBank No.AY184221）进行比对，调整重叠组装匹配度至75%，并根据参考株VP1区序列长度（PV1包含906个碱基，PV2包含903个碱基，PV3包含900个碱基）修剪共有序列，获得完整的VP1区核苷酸序列。WS/T 10058—2026

参考文献

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