附 录 B （规范性） 脊髓灰质炎病毒型内鉴定标准操作流程
B.1 型内鉴定（ITD）标准操作流程 ITD标准操作流程如图B.1所示。ITD所包括的ITD rRT-PCR和VDPV rRT-PCR两个实验的实验步骤和结果判读分别见B.3和B.4。
图 B.1 脊髓灰质炎病毒 ITD 操作流程图 B.2 实验材料 B.2.1 试剂 ITD rRT-PCR和VDPV rRT-PCR可采用商品化一步法rRT-PCR试剂盒。 B.2.2 阳性对照 ITD rRT-PCR和VDPV rRT-PCR的阳性对照均为已知的待检目的基因核酸。 B.2.3 阴性对照 ITD rRT-PCR和VDPV rRT-PCR的阴性对照均为无RNA酶的去离子水。 B.2.4 ITD rRT-PCR引物和探针 ITD rRT-PCR引物和探针共9套，分别检测目的基因EV、Sabin1、Sabin2、Sabin3、PV、WPV1、PV2、WPV3的WEAF基因型（WPV3-WEAF）和WPV3的SOAS基因型（WPV3-SOAS）。参考引物和探针序列及所对应的荧光报告基团见表B.1。 表 B.1 ITD rRT-PCR 引物和探针 B.2.5 VDPV rRT-PCR引物和探针 VDPV rRT-PCR引物和探针为VDPV1和VDPV3。参考引物和探针序列及所对应的荧光报告基团见表B.2。
B.3 实验步骤 B.3.1 准备样品 取100μL L20B阳性分离物置于1.5 mL离心管中，在3000 g、室温条件下离心2min，吸取上清液备用，无需提取病毒RNA。 B.3.2 配制反应体系 不同的商品化一步法rRT-PCR试剂盒配制反应体系不同，具体操作按照试剂盒的说明书进行。以一般通用方法为例，反应体系的配制见表B.3。
B.3.3 加样 取1μL的L20B阳性分离物上清液（或1μL阳性对照或1μL阴性对照）加入上述配制的反应体系中。 B.3.4 设置反应程序 设置反应程序如下：50 ℃反应30min；95 ℃预变性1min；扩增反应95 ℃15s，50 ℃45s， 72 ℃5s，共40个循环；4 ℃保持。不同的荧光定量PCR仪扩增的程序会有一些差异，可根据所使用的仪器对反应程序进行适当调整。 B.4 结果判读 在分析样品的数据之前，应先检查阳性对照和阴性对照。当阴性对照和阳性对照成立时判断结果，Ct值＜28时判断为阳性，28≤Ct值＜30时需要提取RNA进行重新检测，Ct值≥30或没有峰值时判断为阴性。当对照不成立时，需重新检测。 B.5 结果报告 综合ITD rRT-PCR和VDPV rRT-PCR的结果作为ITD的最终报告结果，见表B.4。
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