附录A (规范性附录) 基孔肯雅热血清学检测方法
A.1酶联免疫法检测基孔肯 雅病毒(chi kungunya virus,以下简称CHIKV) I gM抗体(IgM抗体捕获酶联免疫吸附试验) A.1.1 原理 首先用抗人IgM μ链抗体(捕获抗体)包被96孔板，如果待检血清中存在CHIKV抗IgM抗体，则与包被的捕获抗体结合，然后再与CHIKV抗原结合，最后与加入酶标抗CHIKV抗体结合，酶与显色底物相互作用就会出现显色反应。 A.1.2材料和试剂 材料和试剂如下: a)包被液: 碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH9.6， 1.59 g Na2CO3和2.93 g NaHC03溶解于1 L水中； b) 洗液:磷酸盐缓冲液(PBS)，含0.05%吐温20， pH 7.2; c)封闭液:含5%奶粉和0.05%吐温20的PBS; d) 包被抗体:抗人IgMμ链抗体; e) 病毒抗原:灭活的纯化CHIKV抗原，无感染性; f)细胞抗原: 经纯化的未感染病毒细胞培养液; g) 酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的CHIKV单克隆抗体; h)酶底物: TMB; i)终止液: 2N H2SO4; j)临床标本: 急性期病人血清和/或脑脊髓液标本;阳性和阴性血清对照; k) 设备:平底96孔板，洗板机，酶标仪，恒温箱，单通道和多通道移液器，试剂储液槽，保鲜袋，吸水纸。 A.1.3检测方法 按以下步骤操作: . a)用记号笔在酶 标板上标记实验编号，明确每份临床标本的位置。 b) 用pH9.6的包被液按1 :2 000比例稀释抗人IgMμ 链抗体，按75μL/孔加入到96孔板的孔中，4C孵育过夜。 c) 倒掉抗体包被液，把板中剩余液体在吸水纸上吸干。每孔加入封闭液200μL封闭反应板。室温孵育30 min. d) 用洗液在自动洗板机上洗板5次。每次洗涤要保证每孔加满洗液。 e) 病人血清用稀释液进行1: 100稀释，脑脊髓液进行1:10稀释，然后按50μL/孔，各加2孔，同时用稀释液按1 : 100比例稀释阳性对照血清和阴性对照血清,各加2孔。37℃湿盒孵育1 h。洗涤5遍。 f)稀释病毒抗原和细胞抗原。每排左边1孔按50μL/孔加入病毒抗原，每排右边1孔按50μL/孔加入细胞抗原。4℃湿盒孵育过夜。洗涤5遍。 g) 按50μL/孔加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，37C湿盒孵育1 h,洗板5遍。 h)所有孔中加50μL/孔的TMB底物液，包括1孔未加样的空白对照孔。避光室温孵育10 min。抗体阳性的孔中会逐渐显示出蓝色。 i)所有孔中加50μL/孔的终止液，显示蓝色的孔此时会变成黄色。把酶标板放入酶标仪中，在450nm波长处读取OD值。 A.1.4 结果判断 结果判断规则如下: a)如果阳性对照血清病毒抗原孔的光密度(OD)值与细胞抗原孔的OD值之比≥2.1,检测结果有效； b)如果待检标本病毒抗原孔的0D值与细胞抗原孔的OD值之比≥2.1,则可判定待检标本中CHIKV IgM抗体阳性。 A.1.5 意义 病人血清或脑脊髓液标本中CHIKV IgM抗体阳性,表示病人新近感染CHIKV,可作为病例诊断的依据。
A.2间接免疫荧光法 (IFA) 检测基孔肯雅病毒IgG抗体 A.2.1原理 IFA就是先用待检血清中的特异抗体(第一抗体)与固定在玻片上的CHIKV抗原反应，如果血清中存在CHIKV特异性IgM和IgG抗体，就会与荧光标记的抗人IgM和IgG抗体(第二抗体)结合，荧光显微镜下可见有特异荧光。 A.2.2材料和试剂 材料和试剂如下: a) 设备: 10μL、100μL、200μL和1000μL移液器各一支;荧光显微镜; CHIKV抗原片(可用BHK-21、Vero或C6/36等感染细胞制备，低温、干燥、密封保存) ;盖玻片; b)试剂: CHIKV 抗体阳性对照血清、阴性对照血清;荧光素标记抗人IgG和IgM荧光抗体;待检患者血清标本;样品稀释液;磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.2) ;吐温20。 A.2.3检测方法 按以下步骤操作: a)取出抗原片，平衡至室温; b)如果检测IgG抗体,先用标本稀释液稀释待检血清,从1 : 10开始，倍比稀释至所需要的滴度; c)用移液器取适量稀释标本加到每个反应区域(标本量以覆盖所有反应区为准)，避免溢出和产生气泡; d)将加有标本的抗原片 放置在湿盒内，37C温箱孵育30 min; e) 用含2‰吐温20的PBS冲洗抗原片，然后再漂洗5 min; f) 取出抗原片，用吸水纸从抗原片背面和侧面擦去洗液(不得擦拭反应区域)，加入适量的荧光素标记抗人IgM或IgG荧光抗体,分别用于检测IgM或IgG抗体(荧光抗体在使用前须根据说明书用PBS稀释); g)将抗原片 放置在避光的湿盒内，37°C温箱孵育30 min; h)用含2‰吐温20的PBS冲洗抗原片,再将抗原片放入含有1:8000伊文思蓝的吐温20的PBS中漂洗5 min; i) 取出抗原片，用吸水纸从抗原片背面和侧面擦去洗液(不得擦拭反应区域)，用甘油缓冲液封片，盖上盖玻片，避免产生气泡; i)荧光显微镜下观察结果。
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