附录B

(规范性附录)

基孔肯雅热病原学检测方法

B. 1基孔肯雅病毒分离与鉴定(细胞培养)

B.1.1 原理

基孔肯雅病毒( chikungunya virus, 以下简称CHIKV)可感染蚊源C6/ 36细胞以及非洲绿猴肾细胞(Vero)和金黄地鼠肾细胞(BHK21)等哺乳动物细胞，并引起细胞病变效应(CPE)。细胞培养分离物可用特异性免疫荧光试验或特异性核酸扩增试验鉴定是否存在CHIKV。

B. 1.2 材料和试剂

材料和试剂如下:

a) 设备:二氧化碳培养箱、生物安全柜、倒置显微镜;

b)易感细胞: C6/36 或Vero或BHK21;

c)细胞消化液: 2.5 g胰酶溶于1000 mL无钙镁磷酸盐缓冲液中，过滤除菌;

d) 细胞生长液: 100 ml生长液中包含Eagle' s MEM溶液88 ml, 10000 IU/ml青链霉素溶液1 mL, 1%谷氨酰胺1ml，胎牛血清10ml，用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH7.2，用前混匀;.

e) 细胞维持液: 100 m维持液中包含Eagle' s MEM溶液96 mL， 10 000 U/mL青链霉素溶液1 ml,1%谷氨酰胺1 ml， 胎牛血清2 ml,用7. 5%碳酸氢钠溶液调至pH 7. 2，用前混匀。

B.1.3检测方法(以Ver o细胞为例)

按以下步骤操作:

a)生长至单层的细胞管，弃去培养液，加入200μL稀释好的血清标本液，每份血清标本用细胞维持液作1:10、1:100稀释,每个稀释度接种两管,置5%C02的培养箱中37℃吸附1h(C6/36细胞为28℃吸附1 h) ;

b) 吸附1 h后吸出细胞管中的标本液，加入1 mL细胞维持液，同时设正常细胞对照，置5%CO₂培养箱中37℃ (C6/36 细胞为28℃)培养7 d,每天观察是否出现CPE;如果7d后仍未出现CPE，则需再盲传3代。

B. 1.4 结果判断

CHIKV感染Vero细胞可出现典型的CPE，表现为细胞脱落、坏死、破碎等特征。但确定病毒分离成功需经病毒特异性RT-PCR或间接免疫荧光试验对分离物或病变细胞进行鉴定。

B.1.5 意义

从病人血标本中分离到CHIKV，可作为病例确诊的依据。

B.2 基孔肯雅病毒核酸检测

B.2.1 TaqMan探针实时荧光逆 转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)

B.2.1.1 原理

病毒RNA在逆转录酶的作用下产生cDNA，可作为聚合酶链(PCR)扩增反应的模版。TaqMan探针实时荧光定量PCR时,在反应体系中加入一对病毒特异性引物和一条荧光基团标记的病毒特异性探针。TaqMan探针的两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团，在探针完好的情况下，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，因而检测不到荧光信号。在PCR扩 增过程中，探针和引物与目标序列结合，当新生链沿着cDNA模板延伸到荧光标记的探针结合位点时，Taq酶发挥5’→3'核酸外切酶的功能，荧光报告基团与淬灭基团分离，荧光基团释放荧光信号。这样模板每扩增一次，就产生-一个游离的荧光分子，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板可进行定量分析。其中RNA逆转录过程可以和PCR扩增反应同时进行也可先进行逆转录反应再进行PCR扩增。其他类似机制的荧光探针也可用于核酸检测。

B.2.1.2材料和试剂

材料和试剂如下:

a) 设备:移液器(1mL、 200儿、100风、20儿、10和2川)及配套吸头;离心管(1.5 mL、0.2mL和0.1mL);试管架(5mL、1.5m和20风);高速冷冻离心机;旋涡混合器:荧光定量PCR仪等;

b)试剂:病毒核酸提取试剂盒;荧光定量RT-PCR试剂盒;引物及探针等(参考序列如下) :

CHIKV-FP: 5' -TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3'

CHIKV-RP: 5' CCGTGTTGGGATCACTGTTA-3'

CHIKV-P: 5' -FAM-TGCCCACACTGTGA-BHQ1-3' (带下划线的碱基需要LNA修饰)。

B.2.1.3检测方法

按以下步骤操作:

a)病毒RNA提取:待检标本用病毒RNA提取试剂盒提取，操作步骤按说明书进行，制备的病毒核酸作为Real-time RT-PCR 的模板。

b) Real-time RT-PCR扩增: 一步法Real-time RT-PCR检测反应条件为:42℃15 min,95℃2 min,95℃10 s, 62℃30 s, 45个循环，仪器设置在每一循环 62℃退火/延伸步骤读取荧光信号。该反应条件可根据采用的试剂要求进行适当的调整。

B.2.1.4 结果判断

结果判断规则如下:

a)以荧光 PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值,标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值(Ct值)。

b)检测样品的Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，可报告样品特异性核酸检测阳性。检测样品的Ct值介于35～45之间时，属临界区间，建议重复检测。若重复检测结果Ct值≥45.0者为阴性:若Ct值仍介于35～45之间，且扩增曲线有明显的指数增长特征者，可报告样品特异性核酸检测阳性。

c)阳性对照的Ct值应≤32. 0，并出现典型的“S”型扩增曲线;阴性对照Ct值应≥45;否则视为实验结果无效，需重复检测。

B.2.1.5 意义

病人血清中检测到CHIKV核酸表示病人体内存在CHIKV，可作为病例确诊的依据。

B.2.2 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

B.2.2.1原理

病毒RNA在逆转录酶的作用下先转录成模板cDNA,然后在聚合酶的作用下合成特异DNA片段,扩增主要由变性、退火和延伸三个步骤反复循环构成:即在高温(95℃) 下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37℃～55℃) 情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链;在适宜温度下(72℃) 经Taq酶催化，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3'方向延伸，合成新的DNA链。

B.2.2.2 材料和试剂

材料和试剂如下:

a) 设备:移液器(1mL、200μL、100μL、20μL、10μL和2μL)及配套吸头;离心管(1.5 mL、0.2mL和0.1mL);试管架(5mL、1.5mL和20μL);高速冷冻离心机;旋涡混合器;恒温振荡器; PCR 仪等;

b)试剂: CHIKV特异性引物( CHIKV-F,CHIKV-R); RNA提取试剂;一步法RT-PCR检测试剂: CHIKV-F:5'-GGGCGGGTAGTCCATGTTGTAGA-3' ; CHIKV-R: 5'-ACCGGCGTCTACCCATTCATGT-3' 。

B.2.2.3 检测方法

按以下步骤操作:

a)病毒RNA提取:待检标本用病毒RNA提取试剂盒提取，操作步骤按说明书进行，制备的病毒核酸作为RT-PCR的模板。

b) 一步法RT-PCR扩增:反应条件为:逆转录50°C 30 min; PCR反应，94°C 2 min一次，再进行35个循环的94°C 30 s，57°C 30 s，68°C 40 s，最后再以68C 5 min结束。该反应条件可根据不同的试剂进行适当的调整。

B.2.2.4 结果判断

RT-PCR扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带的分子量与预期片段大小(330 bp) 相同，可判定CHIKV核酸扩增阳性。

B.2.2.5 意义

从病 人血标本中检测到CHIKV核酸,表示存在病毒感染，可作为病例确诊的依据。PCR产物还可用于核酸序列分析。