A.2.4结果判断 结果判断规则如下: a)特异性荧 光颗粒在镜下呈现黄绿色，如果抗原片的细胞胞浆中呈现出均匀的颗粒状荧光，可判断CHIKV特异抗体阳性。 b)根据荧光光亮度 和阳性细胞在细胞总数中所占的比例可将荧光反应大致区分为“+ ～ +++”,无特异荧光者为阴性。检测抗体滴度时，抗体滴度为特异荧光达“++”时最高血清稀释度的倒数。 c)如果阳性对 照显示非特异性荧光或阴性对照显示清晰的荧光，试验则不成立，需重复检测。 A.2.5 意义 恢复期血清IgG抗体阳转,或IgG抗体滴度较急性期有4倍及以上增高，均表示病人近期感染了CHIKV,可作为病例确诊的依据。
A.3蚀斑减少中和试验检测基孔肯雅病毒中和抗体 A.3.1原理 血清中CHIKV中和抗体可阻断病毒吸附细胞，而未被中和的病毒仍具有感染细胞的能力，可导致单层细胞病变、脱落等，形成一个局限性的变性细胞区，该区称之为蚀斑。在单层细胞上覆盖含有活性染料的营养琼脂可指示蚀斑的多少。“
蚀斑”是感染了病毒的细胞，病变死亡后无法被染料染上颜色，形成空斑，而未感染病毒的细胞可被活性染料着色，通过颜色的对比可判定蚀斑量。检测血清的中和抗体时，需用已知蚀斑滴定度的参考毒株与待检血清反应，蚀斑数减少表示血清有中和活性，中和反应后能引起50%蚀斑减少的血清稀释度的倒数即为蚀斑减少中和抗体的滴度。蚀斑减少中和试验检测基孔肯雅病毒中和抗体实验应在BSL-3级实验室内进行。 A.3.2材料和试剂 材料和试剂如下: . a) 设备: 4℃冰箱、37℃水浴锅、二氧化碳培养箱、无菌平底6孔组织培养板。 b)易感细胞:健康单层Vero细胞。 c) 细胞生长液: 100 mL生长液中包含Eagle'
s MEM溶液88mL， 10 000IU/mL青链霉素溶液1 mL,1%谷氨酰胺1 mL，胎牛血清10
ml,用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH 7.2, 用前混匀。 d)细胞维持液: 100 mL维持液中包含Eagle'
s MEM溶液96 ml, 10 000 U/mL青链霉素溶液1
mL,1%谷氨酰胺1 mL,胎牛血清2 mL,用7. 5%碳酸氢钠溶液调至pH 7.2， 用前混匀。 e)细胞消化液: 2.5 g胰酶溶于1 000
mL无钙镁磷酸盐缓冲液中，过滤除菌。 f)病毒储备 液及其滴定: CHIKV接种Vero细胞，待细胞出现细胞病理性效应(CPE)达+++后收获病毒，离心后将上清分装到无菌2 mL螺口血清管，冻存到-70C冰箱作为病毒储备液备用。使用前先取一支病毒液进行病毒蚀斑形成单位(PFU) 滴定。具体操作步骤为: 1) 准备3块已长成单层的VERO细胞6孔细胞培养板，并编号; 2) 将病毒液用维持液做连续10倍稀释至10-8，
弃去细胞培养液，然后从最高稀释度起将各稀释度的病毒液加到6孔细胞板中，每个稀释度加两孔，每孔0.1 mL,最后两孔作细胞对照，37℃吸附1 h; 3)准备1%琼脂培养基，并使其保温在43℃,病毒吸附结束后加入琼脂培养基到各细胞孔, 每孔3 mL,轻柔摇晃混匀，确保琼脂将病毒液完全覆盖，大约20 min后，琼脂完全凝固，将平板倒置放入CO2培养箱中，37℃C培养; 4)每天观察计数蚀斑量，并在细胞板的背面用记号笔圈出蚀斑;如果接种10-4稀释度的病毒孔的蚀斑无法计数，接种10-5稀释度病毒的两个细胞孔中平均有100个蚀斑，那么病毒的滴度为107 PFU /mL。 g)其他试剂:阳性对照血清、阴性对照血清、待测血清标本、牛血清白蛋白(BSA)、pH7.4的Tris缓冲液、琼脂糖、中性红。 A.3.3检测方法 按以下步骤操作: a) 待检血清在56℃水浴灭活30 min, 除去血清中的补体和其他干扰因子。. b) 用含1% BSA的维持液稀释病毒至每0.1
mL含有200个蚀斑单位(200 PFU/0.1 mL)。 c) 用含1% BSA的维持液将待检血清先做1 :
5稀释,然后做连续2倍稀释至1 : 160或是所需要的滴度，并保证每个稀释度的工作容量为0.1 mL。 d) 取稀释好的200 PFU/0.1 mL的病毒液0.1 mL, 分别加入0.1 mL不同稀释度的血清中，混匀后，4℃孵育过夜，或者37C孵育1h。 e)取稀释好的200 PFU/0. 1 mL. 的病毒液0.5 ml，加入等量的含1% BSA 的维持液混匀，然后对病毒液做连续10倍稀释，包括:10-1和10-2，这些混合稀释液各自的最终病毒含量要达到100 PFU/0.1
mL、10 PFU/0.1 mL 和1PFU/0.1 ml，最后对病毒液做回滴，并且病毒回滴液和病毒血清混合液在同样条件下孵育。 f)孵育结束后，先将6孔板中的单层细胞培养液吸出,然后加入病毒-血清混合液，每孔0.1 mL。用另外一块细胞培养板加入用于病毒回滴的病毒稀释液，各稀释度加两孔，37℃吸附1 h。 g)准备含中性红的1%琼脂或琼脂糖培养基,加热使其完全溶解后放置43℃水浴使其保持液体状态备用，含有中性红染料的营养琼脂配方为:维持液中加1%琼脂和0.4%中性红。 h)将上述1%琼脂培养基逐一加入病毒血清反应孔和病毒回滴孔中，每孔加入3mL,轻柔摇晃混匀，确保琼脂将病毒-血清混合液完全覆盖。 i) 大约20 min后，琼脂完全凝固，将平板倒置放入CO2培养箱中，37℃培养。 每天观察计数蚀斑量，并在倒置的平板上用记号笔圈出蚀斑。 A.3.4 结果判断 结果判断规则如下: a)病毒回滴试验是为了确定加入的病毒量是否合适,计算病毒回滴试验中的蚀斑数,计算平行孔中的蚀斑数平均值，只有蚀斑量在30～100之间时才计算试验孔中的蚀斑量,最后计算中和抗体滴度。 b)阳性血清对照成立,测定抗体滴度在已知抗体滴度的上下一个稀释度范围内;同时检测细胞对照孔，对照孔细胞形态正常则所做试验结果可靠。只有试验孔出现90%的蚀斑量减少现象才可判定出现了免疫中和反应。比如，逆滴定表明已知攻击病毒滴度为100 PFU/0.1 mL，那么≤10个蚀斑量的血清稀释度就是终点。 c)能中和病毒的最高血清稀释度的倒数就是蚀斑减少中和抗体滴度。 A.3.5意义 恢复期血清抗体滴度比急性期升高4倍或4倍以上或抗体阳转，表示病人近期感染了CHIKV，可作为病例确诊的依据。 |
