5.4质量控制 5.4.1 空白对照 以无 RNase 超纯水作为空自对照(A 反应孔) 5.4.2 阴性对照 以未检出诺如病毒的同种类食品样本,提取 RNA,作为阴性对照(B 反应孔)。 5.4.3 阳性对照 以外加扩增控制 RNA,作为阳性对照(J反应孔)。 5.4.4过程控制病毒 以样品中过程控制病毒的提取效率表示样品中诺如病毒的提取效率,作为病毒提取的过程控制。 5.4.4.1 将10μL 过程控制病毒原液(约为 1010 PFU/mL)按 5.3 步骤提取病毒 RNA,并纯化。 5.4.4.2 将提取和纯化的过程控制病毒 RNA 进行 10 倍梯度稀释(D~G 反应孔),加入过程控制病毒的引物和探针,采用附录B反应体系和参数,确定未稀释和梯度稀释的过程控制病毒 RNA 的 Ct 值。 5.4.4.3 以未稀释和梯度稀释的过程控制病毒 RNA 的浓度的lg值为 X 轴,以对应的 Ct值为Y轴,绘制标准曲线;要求标准曲线r2>0.98。将未稀释的过程控制病毒 RNA 浓度设置为 1,经过 10 倍梯度稀释的过程控制病毒 RNA 浓度分别为 10-1、10-2、10-3等。 5.4.4.4 将含过程控制病毒的食品样品 RNA(C反应孔),加人过程控制病毒引物和探针,采用附录 B反应体系和参数,确定 Ct 值,代人标准曲线,计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒 RNA 浓度。 5.4.4.5 计算提取效率。提取效率一经病毒提取等步骤后的过程控制病毒RNA浓度×100%,即(C反应孔)Ct值对应浓度×100%。 5.4.5 外加扩增控制 通过外加扩增控制 RNA,计算扩增抑制指数,作为扩增控制。 5.4.5.1 将外加扩增控制 RNA(105copies/μL~106copies/uL)分别加人含过程控制病毒食品样品RNA(H 反应孔)、10 倍稀释的含过程控制病毒食品样品 RNA(I反应孔)、无 RNase 超纯水(1反应孔)中,同时加人 GI或 GⅡ基因组的引物和探针,采用附录B反应体系和参数,进行实时荧光 RT-PCR反应,确定 Ct值。 5.4.5.2 计算扩增抑制指数。扩增抑制指数=Ct 值(含过程控制病毒食品样品 RNA+外加扩增控制RNA)-Ct 值(无 RNase 超纯水+外加扩增控制 RNA),即扩增抑制指数=Ct 值(H反应孔)-Ct 值(J反应孔)。如抑制指数>2.00,需比较经过 10 倍稀释的食品样品 RNA 的扩增抑制指数,即扩增抑制指数=Ct 值(I反应孔)-Ct 值(J反应孔)。 5.5实时荧光 RI-PCR 实时荧光 RT-PCR 反应体系和反应参数详见附录B。反应体系中各试剂的加入量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。可采用商业化试剂盒,按照试剂盒的说明书进行操作。也可增加或调整反应孔,实现1次反应完成诺如病毒 GI和 GⅡ基因组的独立检测。首先配制荧光 RT-PCR 反应的预混液,按照附录B中表 B,1 的顺序及加样量,依次将 RT-PCR 缓冲液、MgSO.、dNTPs、逆转录酶、DNA 聚合酶和无 RNase 超纯水进行混合,制备成荧光 RT-PCR反应预混液。将反应预混液分别添加至不同反应孔(15.88 μL/孔),再向每个反应孔加入下述物质,分别检测 GI或GⅡ基因组的诺如病毒以及过程控制病毒和计算扩增抑制指数。 A 反应孔:空自对照,加人 5.0 μL 无 RNase 超纯水+4.12μL GI或GⅡ基因组的诺如病毒引物和探针； B反应孔:阴性对照,加人5.0μL阴性对照样品 RNA+4.12μL GI或GⅡ基因组的诺如病毒引物和探针； C 反应孔:加人 5.0μL含过程控制病毒食品样品 RNA+4.12μL 过程控制病毒引物和探针； D 反应孔:加人5.0μL 过程控制病毒 RNA+4.12 μL 过程控制病毒引物和探针； E 反应孔:加人5.0μL 10 倍稀释的过程控制病毒 RNA+4.12 μL 过程控制病毒引物和探针； F 反应孔:加人5.0μL 100 倍稀释的过程控制病毒 RNA+4.12 μL 过程控制病毒引物和探针； G 反应孔:加入5.0uL 1000 倍稀释的过程控制病毒 RNA+4.12 uL 过程控制病毒引物和探针； H 反应孔:扩增控制1,加人5.0μL含过程控制病毒食品样品 RNA+1.0uL外加扩增控制 RNA+4.12uL GI或 GⅡ基因组的诺如病毒引物和探针； I反应孔:扩增控制 2,加人5.0uL 10 倍稀释的含过程控制病毒食品样品 RNA+1.0μL外加扩增控制 RNA+4.12μL GI或 GⅡ基因组的诺如病毒引物和探针； J反应孔:扩增控制 3/阳性对照,加人5.0μL,无 RNase 超纯水+1.0uL,外加扩增控制 RNA+4.12μL GI或 GⅡ基因组的诺如病毒引物和探针； K 反应孔:样品1,加入5.0μL含过程控制病毒食品样品 RNA+4.12μL GI或 GⅡ基因组的诺如病毒引物和探针； L 反应孔:样品 2,加入5.0μL 10 倍稀释的含过程控制病毒食品样品 RNA+4.12μL GI或 GⅡ基因组的诺如病毒引物和探针。
6结果与报告 6.1检验有效性判定 6.1.1 需满足以下质量控制要求,检验结果方有效:空白对照阴性(A 反应孔)、阴性对照阴性(B 反应孔)阳性对照阳性(反应孔)。 6.1.2 过程控制(C-G 反应孔)需满足:过程控制病毒提取效率≥1%:如果提取效率<1%,需重新检测;如果提取效率<1%,诺如病毒检测结果为阳性,判定为检测结果有效。 6.1.3 扩增控制(H-J反应孔)需满足:扩增抑制指数<2.00;如果扩增抑制指数≥2.00,需比较10倍稀释食品样品 RNA 的扩增抑制指数；如果10倍稀释食品样品 RNA 的扩增抑制指数<2.00,则扩增有效,且需采用 10 倍稀释食品样品 RNA 的 Ct 值作为检测结果;如果 10 倍稀释食品样品 RNA 的扩增抑制指数≥2.00,扩增无效,需要重新检测;如果 10 倍稀释食品样品 RNA 的扩增抑制指数≥2.00,诺如病毒检测结果为阳性,判定为检测结果有效。 6.2结果判定 待测样品(K 反应孔或L反应孔)Ct 值≥45 时,判定诺如病毒 GI或 GⅡ基因组检测结果阴性；待测样品(K 反应孔或1 反应孔)Ct 值≤38 时,判定诺如病毒GI或 GⅡ基因组检测结果阳性;待测样品(K 反应孔或L反应孔)Ct 值 38<Ct<45 时,应重复检测;重复检测结果 Ct 值≥45 时,判定诺如病毒GI 或 GI基因组检测结果阴性；重复检测结果 Ct值<45 时,判定诺如病毒 GI或 GI基因组检测结果阳性。 样品平行处理的检测结果,只要其中一个结果为阳性,则判定该样品诺如病毒 GI或GⅡ基因组检测结果阳性 6.3结果报告 根据检测结果,报告“××g(××mL 或××cm2)样品检出诺如病毒基因”或“××g(××mL 或××cm2)样品未检出诺如病毒基因”。
7其他 生物安全措施按 GB 19489 规定的要求严格执行。 |
