附录E RNase 的去除和无 RNase 溶液的配制
配制溶液用的酒精,异丙醇等应采用未开封的新品。配制溶液用的超纯水,玻璃容器、移液器吸头药匙等用具应无 RNase。操作过程应始终佩戴一次性乳胶手套,并经常更换,以避免 RNase 污染用具或带人溶液。 E.1 RNase 的去除 E.1.1玻璃容器应在 240 ℃烘烤 4 h,去除 RNase。 E.1.2 离心管、移液器吸头、药匙等耗材使用 DEPC水(0.1%,体积分数)室温浸泡过夜,然后灭菌,烘干;或直接购买无 RNase 的相应耗材。 E.2 无RNase 溶液的配制 E.2.1 无 RNase 超纯水 E.2.1.1 成分 超纯水 100mL 焦碳酸二乙酯(DEPC) 100μL E.2.1.2 制法 室温过夜,121 ℃,15 min 灭菌,或直接购买无 RNase 超纯水。 E.2.2 Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGBE)缓冲液 E.2.2.1 成分 三(羟基甲基)氨基甲烷(C4H11NO3) 12.1g 甘氨酸(C2H5NO2) 3.8g 牛肉膏 10.0g 无 RNase 超纯水定容至 1000.0mL E.2.2.2 制法 将固体物质溶解于 900.0 mL,无 RNase 超纯水中,室温,调节 pH 至9.5。然后,用无RNase 超纯水定容至 1 000.0 mL,高压灭菌。 E.2.3 5×PEG/NaCl溶液 E.2.3.1 成分 聚乙二醇(PEG)8 000 500.0 g 氯化钠(NaC1) 87.0 g 无 RNase 超纯水定容至 1000.0 mL E.2.3.2制法 将固体物质溶解于 450.0 mL 无 RNase 超纯水中,可缓慢加热,待固体物质完全溶解后,用无RNase 超纯水华全1 000.0 mL;充分混匀，高压火菌后备用。 E.2.4磷酸盐缓冲液(PBS) E.2.4.1 成分 氯化钠(NaCl) 8.00 g 氯化钾(KC1) 0.20 g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 1.15 g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.20 g 无 RNase 超纯水定容至 1000.0 mL E.2.4.2 制法 将固体物质溶解于 900.0 mL无 RNase 超纯水中,室温,调节 pH 至 7.3,然后用无 RNase 超纯水定容至1 000.0 mL,高压灭菌后备用。 E.2.5 三氯甲烷/正丁醇混合液 E.2.5.1 成分 三氯甲烷(CHC13) 10.0 mL 正丁醇[CH3(CH2)3OH] 10.0 mL E.2.5.2 制法 将上述组分充分混匀。 E.2.6蛋白酶 K 溶液 E.2.6.1 成分 蛋白酶K(30 U/mg) 20.0 mg 无 RNase 超纯水 定容至 200.0 mL E.2.6.2 制法 将蛋白酶K 充分溶于 150.0 mL无RNase 超纯水中,然后用无RNase 超纯水定容至200.0 mL。分装,一20 ℃保存,最多可存放6个月。一旦解冻使用,4 ℃保存,可在1周内使用。 E.2.7 75%乙醇 E.2.7.1 成分 无水乙醇(CH3CH2OH) 7.5 mL 无 RNase 超纯水 2.5 mL E.2.7.2 制法 7.5mL无水乙醇中加人2.5mL无 RNase 超纯水,充分混匀,现配现用。 E.2.8 Trizol试剂 E.2.8.1 成分 异硫氰酸胍(C2H6N4S) 250.0 g 0.75 mol/L 柠檬酸钠(C6H5Na3O7)溶液(pH≥7) 17.6 mL 10%十二烷基肌氨酸钠(C15H10NO4Na)溶液 26.4 mL 2 mol/1 醋酸钠(CH3COONa)溶液(pH≥4) 50.0 mL 无 RNase 超纯水 293.0 mL 重蒸苯酚(C6H5OH) 500.0 mL E.2.8.2 制法 在 2 000 mL, 的烧杯中加人无 RNase 超纯水,然后依次加人异硫氰酸胍、0.75 mo1/L 柠檬酸钠溶液、10%十二烷基肌氨酸钠溶液、2 mo1/1,醋酸钠溶液,混合均匀;然后加人重蒸苯酚,充分混匀。Trizo1试剂需4℃低温保存,保质期约1年。也可使用商业化的试剂。 E.2.9 6mol/ 盐酸溶液 E.2.9.1 成分 浓盐酸(HC1) 10.0 mL 无 RNase 超纯水 10.0 mL E.2.9.2 制法 将 10 mL浓盐酸缓慢加人10mL 无RNase 超纯水中,充分混匀。 E.2.10 1mol/氢氧化钠溶液 E.2.10.1 成分 氢氧化钠(NaOH) 40.08 无 RNase 超纯水 定容至 1000.0 mL E.2.10.2 制法 将40.0g氢氧化钠固体粉末溶于 900.0 mL 元 RNase 超纯水中,充分混匀,然后用无 RNase 超纯水定容至 1 000.0 mL。 |
