附录C

过程控制病毒培养及引物和探针

C.1门哥病毒

C.1.1概要

本标准使用门哥病毒作为过程控制病毒进行过程控制,也可使用大肠埃希氏菌噬菌体 MS2 或其他等效、不与诺如病毒存在交叉反应的病毒。门哥病毒是小核糖核酸病毒科的鼠病毒。门哥病毒株 MC₀(ATCC® VR-1597^TM)是一种重组病毒,与野生型门哥病毒相比缺乏 poly[C],是与野生型门哥病毒具有相似生长特性的无毒表型，门哥病毒株 MC₀是一种转基因生物,如果实验室不允许使用转基因生物,可以使用其他的过程控制病毒。也可以使用商业化试剂或试剂盒中的门哥病毒作为过程控制病毒

C.1.2 试剂与耗材

C.1.2.1 HeLa细胞培养液

推荐使用含有 2 mmol/L L-谷氨酸的 Ea&le 基础培养液(Eagle's minimum essential medium;MEM)培养 HeLa 细胞,并将培养液中碳酸氢钠的终含量调整为 1.5 g/L,非必需氨基酸的终浓度调整为 0.1 mmol/L,丙酮酸钠的终浓度调整为 1.0 mmol/L。向培养液中加入胎牛血清,使胎牛血清终含量为 100 mL/L(胎牛血清/培养液)(细胞生长波)或 20 mL/L(胎牛血清/培养液)(细胞维持液)。

C.1.2.2 耗材

细胞培养所需耗材(例如细胞培养瓶)等。

C.1.3 仪器

二氧化碳(CO，)浓度可调节的恒温培养箱。

倒置显微镜。

C.1.4培养过程

将门哥病毒加人铺满 80%~90%的单层 HeLa(ATCC CCL-2^TM)细胞的细胞培养瓶中,置于5%浓度的二氧化碳恒温培养箱中,37 ℃进行培养,直至细胞培养瓶中有75%的 HeLa细胞出现细胞病变效应。将细胞培养瓶经过一个冻融循环,然后取出培养液,3 000×g离心10min,将上清液冻存于-80℃冰箱,用于诺如病毒检验方法的过程控制。

C.1.5 引物和探针

门哥病毒实时荧光 RT-PCR 的引物和探针见表 C.1。采用其他等效的过程控制病毒,需对应调整引物和探针。

表 C.1 门哥病毒实时荧光 RT-PCR 的引物和探针

C.2大肠埃希氏菌噬菌体 MS2

C.2.1概要

本标准采用的大肠埃希氏菌噬菌体 MS2 属于单链 RNA 轻小噬菌体科,直径约 26 nm,正二十面体结构,直径与肠道病毒相当。大肠埃希氏菌噬菌体 MS2 对宿主具有高度的特异性,仅感染大肠埃希氏菌,是 RNA 病毒检测理想的质控物质,成为理想的人类致病病毒替代物。如果实验室不能培养大肠埃希氏菌噬菌体 MS2,也可以使用商业化试剂或试剂盒中的大肠埃希氏菌噬菌体 MS2 作为过程控制病毒。

2.2试剂与耗材

C.2.2.1 菌株和大肠埃希氏菌噬菌体 MS2

大肠埃希氏菌噬菌体 MS2(ATCC15597-B1^TM)及其宿主细菌E.coli(ATCC 15597),或等效的大肠埃希氏菌噬菌体 MS2 和等效菌株。

C.2.2.2 试剂

细菌培养所需试剂(例如 LB 增菌液、TSA-YE 培养基等)。

C.2.2.3 耗材

细菌培养所需耗材(例如无菌培养皿)等。

2.3仪器

恒温培养箱、全温振荡。

C.2.4培养过程

2.4.1宿主菌的制备

用接种环挑取一环宿主菌 E.coli(ATCC 15597 或等效菌株)接种在 TSA-YE平板上,36 ℃±1 ℃过夜培养;随后,挑取单个菌落至10mL LB增菌液中,36 ℃士1℃,培养过夜。

C.2.4.2 大肠埃希氏菌噬菌体 MS2 制备

C.2.4.2.1 将C.2.4.1制备的含宿主菌的 LB增菌液按照 0.5%(体积分数)接种到新的 LB增菌液中，36 ℃±1 ℃,150 次/min 振荡培养4 h~5 h,然后,按 0.5%~1%(体积分数)将噬菌体(10⁸PFU/mL~10⁹PFU/mL)接种到上述含有宿主菌的增菌液中。

C.2.4.2.2 将接种噬菌体的宿主菌增菌液在 36 ℃士1 ℃,150 次/min振荡培养5h或静置过夜。按照增菌液体积的 2%加入三氯甲烷,200 次/min 振荡 10 min,随后,将增菌液 10000×g离心 10 min,收集上清液,用孔径为0.45μm 的滤膜过滤,即得纯化的大肠埃希氏菌噬菌体 MS2,分装于5ml 冻存管-80 ℃保存。

C.2.5引物和探针

大肠埃希氏菌噬菌体 MS2 实时荧光 RT-PCR 的引物和探针见表 C.2。采用其他等效的过程控制病毒,需对应调整引物和探针。

表 C.2 大肠埃希氏菌噬菌体 MS2 实时荧光 RT-PCR 引物和探针