附录D 外加扩增控制 RNA 制备
D1概要 将目标 DNA 序列连接至合适的质粒载体上,确保目标序列位于质粒载体 RNA 聚合酶启动子序列的下游。然后将含有目标序列的质粒线性化,再将线性化质粒加人体外 RNA 转录反应试剂中,从而制备外加扩增控制 RNA。GI基因组外加扩增控制 RNA 的目标序列位于诺如病毒(GenBank 登录号M87661.2)的5291 bp~5 376 bp之间。GⅡ基因组外加扩增控制 RNA 的目标序列位于诺如病毒(GenBank登录号X86557.1)的5012 bp~5 100 bp 之间。 D.2试剂与耗材 D.2.1 DNA连接酶及缓冲液:用于 DNA 连接及相关的缓冲液。 D.2.2限制性内切酶及缓冲液:用于制备线性化质粒。 D.2.3 DNA纯化试剂。 D.2.4体外RNA转录试剂(RNA 聚合酶、dNTPs、缓冲液等)。 D.2.5元RNase 的DNase. D.2.6 RNA纯化试剂。 D.2.77 DNA凝胶电泳相关试剂 D.3 仪器 D.3.1 DNA凝胶电泳仪。 D.3.2培养箱:37℃。 D.4 质粒 DNA 连接 合成诺如病毒 GI或者 GⅡ的目标序列并进行纯化。将 100 ng~500 ng经过纯化的目标 DNA 和质粒载体加人含有合适的 DNA 连接酶及缓冲液的反应体系中,连接质粒和目标序列,并确保目标序列位干质粒载体 RNA 聚合酶启动子序列的下游。37 ℃孵育 120 min。使用胶电泳检査 DNA 与质粒的连接情况。 D.5 外加扩增控制 RNA 的制备 使用合适的限制性内切酶将质粒切开(酶切位点位于目标序列的下游),获得携带诺如病毒 GI或者 GⅡ目标序列的线性化质粒。将1μg经过纯化的线性化质粒 DNA 加人体外 RNA 转录反应试剂中。37 ℃孵育 120 min。然后,向反应液中添加无 RNase 的 DNase,并在 37 ℃下孵育 15 min。使用RNA 纯化试剂盒纯化 RNA,然后分装,一80℃储存,实验前取出备用。 注:逆转录温度应根据使用的逆转录酶的最适使用温度决定。可使用等效的商业化检测试剂盒中的外加扩增控制RNA 储备液,或请符合要求的合格供应商代为制备。 |
