5.2病毒提取 5.2.1 软质水果和生食蔬菜 5.2.1.1 将 25g软质水果(由子房发育成的柔软多汁的肉质水果的统称,如草莓、葡萄)或生食蔬菜(如生菜)在无菌条件下切成约2.5cm×2.5cm×2.5cm的小块(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)。 5.2.1.2 将样品小块移至无菌均质袋(带滤网,容积 400 mL)中,加人 10 uL 过程控制病毒,再加人 40 mITGBE 缓冲液(软质水果样品,需加人 30 U Aspergillus niger 果胶酶,或1140 U Aspergillus aculealus 果胶酶)。 5.2.1.3 使用全温振荡器,在室温条件下,60 次/min,振荡 20 mmin。酸性软质水果(软果经焚烧后的灰分溶解在水中后 pH 小于 7.0 的软质水果,例如草莓、杨梅、覆盆子)需在振荡过程中,每隔 10 mmin 测定pH,当 pH 低于 9.0 时,使用1 mol/L NaOH 调 pH 至 9.5,毎调整1次 pH,延长振荡时间 10 min。 5.2.1.4 将提取液转移至 50 mL离心管,如体积较大,使用2支离心管。10 000×g;4℃,离心 30 min。取上清至无菌试管或三角瓶,用6 mol/L HCl 调 pH 至 7.0。 5.2.1.5 向提取液中加人 0.25 倍提取液体积的5XPEG/NaCl 溶液,使 PEG/NaCl 在提取液中的终含量为 100 g/L PEG,0.3 mol/L NaCl。室温,摇匀1 min,然后,4 ℃,60 次/min,振荡 60 min 或4 ℃静雪过夜。10 000×g:4 ℃,离心 30 min,弃上清。10 000Xg;4 ℃,离心5 min 紧实沉淀,弃上清。 5.2.1.6 加人 500 μL PBS 重悬沉淀。如样品为生食蔬菜,直接将重悬液转移至无 RNase 离心管中,测定并记录重悬液体积,用于后续 RNA 提取。如样品为软质水果,将重悬液转移至耐三氢甲烷的无菌离心管中,加人 500 μL 三氣甲烷/正丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5 min,10 000×g,4 ℃,离心15 min,将上清液转移至无 RNase 离心管中,测定并记录上清液体积,用于后续 RNA 提取。 5.2.2硬质表面食品 5.2.2.1 将无菌棉拭子使用 PBS 湿润后,用力擦拭食品表面(如胡萝卜、瓜、坚果,50 cm2≤擦拭面积≤100 cm2),记录擦拭面积。将 10 μL过程控制病毒添加至该棉拭子。如果食品表面过于粗糙,可能会损坏棉拭子,可使用多个棉拭子,但只需在其中一个棉拭子上添加过程控制病毒。 5.2.2.2 将棉拭子浸人含 490 μL PBS 试管中,紧贴试管一侧挤压出液体。如此重复浸入和挤压3次~4 次,确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体体积,用于后续 RNA 提取。 5.2.3贝类 5.2.3.1戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少 10 个贝类样本。 5.2.3.2 使用无菌剪刀、无菌镊子或其他等效器具在橡胶垫上解剖贝类样本,取出贝类消化腺,置于无菌培养皿中。收集2g贝类消化腺。 5.2.3.3 使用研钵或等效均质器将贝类消化腺匀浆后,转移至离心管。加人10μL过程控制病毒。加人 2.0 mL 蛋白酶K 溶液;混匀。 5.2.3.4使用全温振荡器或等效装置,37℃,320 次/min,振荡 60 min。 5.2.3.5将离心管放人水浴或等效装置,60 ℃,15 min。随后,3 000Xg,室温,离心5min,将上清液转移至无 RNase 离心管中,测定并记录上清液体积,用于后续 RNA 提取。 5.24包装饮用水 5.2.4.1 取包装饮用水样品(≤1000mL),加入10μL过程控制病毒,振荡混匀。 5.2.4.2 向样品中加入一定质量的氣化镁(例如每升包装饮用水中加入 4.76g氯化镁),充分溶解并混匀,使 Mg2-终浓度为 0.05 mol/L. 5.2.4.3 用6 mol/1 盐酸调节水样 pH 至 3.0。 5.2.4.4 用无菌镊子夹取混合纤维素膜(孔径0.45 um,直径47 mm),置于过滤瓶上,进行抽滤,使所有水样全部通过混合纤维素膜。 5.2.4.5 用无菌镊子取出混合纤维素膜,用无菌剪刀将滤膜剪碎,放人50m离心管中,加人15mLTGBE 缓冲液;以 400 次/min,室温振荡 30 min。 5.2.4.6 将离心管中的提取液全部转移至另外一个无菌的 50 mL离心管中。 5.2.4.7 用6 mol/1 盐酸调节提取液的 pH至 7.0,并将提取液全部转移至超滤浓缩离心管中。 5.2.4.8 5000×g,室温,离心 15 min。随后,将浓缩管中的提取液转移至一个无 RNase 离心管中,测定并记录提取液的体积;用于后续 RNA 提取。 5.3 病毒 RNA 提取和纯化 注:病毒 RNA 可手工提取和纯化:也可使用等效商品化病毒 RNA 提取试剂盒进行提取和纯化。病毒 RNA 提取完成后,为延长 RNA 保存时间可选择性加人 RNase 抑制剂。操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换。提取出来的 RNA 可立即进行检测,或在4℃下保存不超过8h,或在-80 ℃冰箱中保存不超过30d。 5.3.1病毒裂解 将全部病毒提取液加人离心管,加入等体积的 Trizol 试剂,混匀,剧烈涡旋振荡1 min(大约1 800 r/min),室温放置5 min,加人 0.2倍体积三氣甲烷,涡旋混匀 30 s(不能过于剧烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀),12 000×g,离心5 min,上层水相移人新的无 RNase 离心管中,避免吸出中间层。 5.3.2病毒 RNA 提取 向离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5 min,12 000×g;室温,离心5min,弃上清,倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应用不同独立的吸水纸沾干),防止交叉污染。 5.3.3 病毒 RNA 纯化 5.3.3.1 加入1mL 75%乙醇,颠倒洗涤 RNA沉淀,12 000×g;4 ℃,离心 10 min,小心弃上清。 5.3.3.2 重复加人1mL 75%乙醇,颠倒洗涤 RNA沉淀,12 000×g,4 ℃,离心10 min;小心弃上清;然后将离心管倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品应用不同独立的吸水纸沾干),防止交叉污染。或用微量移液器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到沉淀物,室温干燥3min,不能过于干燥,以免 RNA 不溶于水。 5.3.3.3 加人50μL无 RNase 超纯水,轻轻混匀,溶解沉淀至离心管底部的 RNA,2000×g;室温,离心5s,冰上保存备用。
|
