污水中新型冠状病毒监测技术规范（WS/T 10042-2025）

附 录 A

（规范性）

病毒富集浓缩和核酸检测

A.1 病毒富集浓缩

A.1.1 聚乙二醇沉淀法

A.1.1.1 原理

向污水中加入聚乙二醇，聚乙二醇在一定盐浓度条件下可使病毒颗粒形成多聚体，在一定离心力下将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，用于后续核酸提取和RT-qPCR检测。方法检出限为10⁰ copies/mL浓度水平。

A.1.1.2 试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T 6682规定的一级水。

A.1.1.2.1 聚乙二醇：平均相对分子质量为 8 000。

A.1.1.2.2 氯化钠。

A.1.1.2.3 带盖离心管：1.5 mL、50 mL，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。

A.1.1.2.4 移液器吸头：1 mL，带滤芯，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。

A.1.1.2.5 移液管：50 mL，无菌，材质为聚丙烯。

A.1.1.3 仪器和设备

A.1.1.3.1 低温摇床：4 ℃。

A.1.1.3.2 冷冻离心机：4 ℃，50 mL 转子，可承受离心力≥5 000 g；4 ℃，1.5 mL 或 2 mL 转子，可承受离心力≥20 000 g。

A.1.1.3.3 微型瞬时离心机：配备 1.5 mL 或 2 mL 转子，可承受离心力≥2 000 g。

A.1.1.3.4 电子天平：感量不低于 0.001 g。

A.1.1.3.5 生物安全柜：Ⅱ级。

A.1.1.3.6 高压蒸汽灭菌器。

A.1.1.3.7 移液器：1 mL、50 mL。

A.1.1.3.8 涡旋混匀器。

A.1.1.4 富集浓缩步骤

A.1.1.4.1 预离心

如果污水样本悬浮物含量过高，可采用低速离心去除较大的悬浮物后再进行后续富集。预离心会造成病毒损失，故在悬浮固体质量浓度≤400 mg/L的情况下不宜进行预离心处理，操作时可根据污水摇匀后是否有明显可见的大粒径颗粒物作为是否需要进行预离心的判定标准。预离心操作为：取适量污水样本在4 ℃ 2 000 g条件下离心2 min，留取上清液备用。离心机停止转动后应立即转移上清液，防止沉淀再次悬浮。剩余污水样本作为备份。

A.1.1.4.2 第二次离心

分别称取4.0 g±0.1 g聚乙二醇和0.80 g±0.01 g氯化钠，放入1个新的50 mL离心管中，用移液器将40 mL污水样本或预离心后的上清液转移至上述离心管中，充分混匀至聚乙二醇完全溶解后置于低温摇床中，在4 ℃ 150 r/min条件下振荡120 min。将振荡后样本在4 ℃ 4 800 g条件下离心45 min，弃除上清液，保留1 mL液体反复吹吸沉淀，瞬时离心，将所有液体转移至1.5 mL离心管中。倾倒上清液时，动作应缓慢，避免因发生振动导致沉淀再次悬浮。

A.1.1.4.3 第二次浓缩

将A.1.1.4.2中的1.5 mL离心管在4 ℃ 20 000 g条件下离心8 min，弃除上清液至剩余500 μL，充分涡旋混匀，得到病毒浓缩液。于0 ℃～4 ℃条件下保存，并于24 h内完成核酸提取和RT-qPCR检测。

A.1.2 铝盐混凝沉淀法

A.1.2.1 原理

向污水中加入铝盐混凝剂，铝盐水解产生的氢氧化铝胶体可吸附和包裹病毒颗粒，通过离心作用收集含病毒的胶体，然后通过化学溶解释放出包裹的病毒颗粒，用于后续核酸提取和RT-qPCR检测。方法检出限为10⁰ copies/mL浓度水平。

A.1.2.2 试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水为GB/T 6682规定的一级水。

A.1.2.2.1 氯化铝溶液[c（AlCl₃）=0.3 mol/L]：称取 4 g 无水氯化铝，置于烧杯中，加入 100 mL 水，搅拌溶解后转移至试剂瓶中。

A.1.2.2.2 氢氧化钠溶液[c（NaOH）=1 mol/L]：称取 4 g 氢氧化钠，置于烧杯中，加入 100 mL 水，搅拌溶解后转移至试剂瓶中。

A.1.2.2.3 盐酸溶液[c（HCl）=1 mol/L]：移取 43 mL 浓盐酸（ρ20=1.19 g/mL）于烧杯中，加入适量水，用玻璃棒搅拌混匀后转移至 500 mL 容量瓶中，用水定容至刻度。

A.1.2.2.4 乙二胺四乙酸二钠二水合物（C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O）：纯度≥98%。

A.1.2.2.5 螺口锥形瓶：100 mL，无菌。

A.1.2.2.6 带盖离心管：10 mL、50 mL，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。

A.1.2.2.7 移液器吸头：200 μL、1 mL，带滤芯，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。

A.1.2.2.8 移液管：50 mL，无菌，材质为聚丙烯。

A.1.2.3 仪器和设备

A.1.2.3.1 冷冻离心机：4 ℃，50 mL 转子，可承受离心力≥2 000 g。

A.1.2.3.2 恒温振荡培养箱。

A.1.2.3.3 电子天平：感量不低于 0.001 g。

A.1.2.3.4 pH 计：精度≥0.01。

A.1.2.3.5 水浴锅。

A.1.2.3.6 生物安全柜：II 级。

A.1.2.3.7 高压蒸汽灭菌器。

A.1.2.3.8 移液器：200 μL、1 mL、50 mL。

A.1.2.4 富集浓缩步骤

A.1.2.4.1 预离心

如果污水样本悬浮物含量过高，可采用低速离心去除较大的悬浮物后再进行后续富集。预离心会造成病毒损失，故在悬浮固体质量浓度≤400 mg/L的情况下不宜进行预离心处理，操作时可根据污水摇匀后是否有明显可见的大粒径颗粒物作为是否需要进行预离心的判定标准。预离心操作为：取适量污水样本在4 ℃ 2 000 g条件下离心2 min，留取上清液备用。离心机停止转动后应立即转移上清液，防止沉淀再次悬浮。剩余污水样本作为备份。

A.1.2.4.2 絮凝处理

用移液器将50 mL污水样本或预离心后的上清液转移至100 mL螺口锥形瓶中，加入0.5 mL 0.3 mol/L的氯化铝溶液，用1 mol/L氢氧化钠溶液或1 mol/L盐酸溶液调节水样pH为6.0±0.1。将螺口锥形瓶瓶盖拧紧，置于恒温振荡培养箱中，以150 r/min的速度在室温下振荡15 min。

A.1.2.4.3 离心分离

将水样转移至50 mL离心管中，在4 ℃、1 900 g条件下离心5 min。

A.1.2.4.4 络合溶解

倾倒弃除离心管中的上清液，在剩余胶体中加入0.10 g±0.01 g乙二胺四乙酸二钠二水合物，摇晃数十次至胶体变为液态，转移至10 mL离心管中。将10 mL离心管置于水浴锅中，60 ℃水浴10 min。水浴后离心管中的液体即为该水样的病毒浓缩液，体积约为1 mL，于0 ℃～4 ℃条件下保存，并于24 h内完成核酸提取和RT-qPCR检测。

A.1.3 超滤法

A.1.3.1 原理

使用一定截留分子量的超滤膜对污水进行过滤，过滤过程中污水中的病毒颗粒会被超滤膜截留并富集于超滤膜表面的膜污染层中，刮取膜污染层对病毒进行回收，重新定容，用 于后 续核 酸提 取和RT-qPCR检测。方法检出限为10⁰ copies/mL浓度水平。

A.1.3.2 试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水为GB/T 6682规定的一级水。

A.1.3.2.1 氨丁三醇-乙二胺四乙酸缓冲液：pH=8.0，其中氨丁三醇（Tris）浓度为 0.01 mol/L，乙二胺四乙酸（EDTA）浓度为 0.001 mol/L，无菌，无核酸酶。

A.1.3.2.2  75%酒精。

A.1.3.2.3 超滤膜：直径为 90 mm、100 mm 或 142 mm，材质为聚醚砜或聚砜，切割分子质量不大于100 kDa，应具有致密的表面分离层。

A.1.3.2.4 刮刀：材质为聚四氟乙烯，尺寸应可放入 1.5 mL 或 2 mL 离心管，使用前用 75%酒精进行浸泡消毒。

A.1.3.2.5 镊子：材质为不锈钢。

A.1.3.2.6 带盖离心管：1.5 mL 或 2 mL，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。

A.1.3.2.7 移液器吸头：1 mL，带滤芯，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。

A.1.3.2.8 移液管：50 mL，无菌，材质为聚丙烯。

A.1.3.2.9 烧杯：200 mL。