A.2.2 RT-qPCR检测 A.2.2.1 试剂和材料 A.2.2.1.1 新冠病毒核酸检测试剂盒（荧光
PCR 法）：应选择新冠病毒通用或特定变异株适用的核酸检测试剂盒，试剂盒检出限宜小于 500 copies/mL。实验室在首次使用和更换核酸检测试剂盒时应进行方法验证。 A.2.2.1.2 新冠病毒核酸基因组标准品：有证标准物质。 A.2.2.1.3 标准品稀释液。 A.2.2.1.4 无核酸酶水：分子生物学级。 A.2.2.1.5 移液器吸头：10 μL、100 μL、200 μL、1 mL，带滤芯，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。 A.2.2.1.6 PCR 管或 PCR 板：无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。 A.2.2.2 仪器和设备 A.2.2.2.1 实时荧光 PCR 仪。 A.2.2.2.2 混匀器。 A.2.2.2.3 生物安全柜：II 级。 A.2.2.2.4 移液器：10 μL、100 μL、200 μL、1 mL。 A.2.2.2.5 其他仪器和设备：参照所用新冠病毒核酸检测试剂盒说明书。 A.2.2.3 检测步骤 A.2.2.3.1 新冠病毒核酸标准曲线绘制 A.2.2.3.1.1 新冠病毒核酸标准物质选择：使用新冠病毒核酸基因组有证标准物质制备标准曲线，标准物质中开放读码框 1ab 基因（ORF1ab）和核壳蛋白基因（N）序列范围应覆盖 RT-qPCR 检测试剂盒扩增序列。 A.2.2.3.1.2 标准曲线浓度梯度选择：标准曲线应至少设置 5 个点，将标准物质原溶液依次进行梯度稀释，标准曲线最低点浓度应临近 RT-qPCR 检测试剂盒检出限，标准曲线浓度范围应覆盖所有样本核酸浓度水平。 A.2.2.3.1.3 标准曲线 PCR 扩增反应体系配制：按照 RT-qPCR 检测试剂盒说明书配制反应体系，每个浓度水平核酸样本应取 3 份用于扩增检测，即做 3 个平行样本。 A.2.2.3.1.4 标准曲线绘制：将分装好的
PCR 扩增反应体系按 RT-qPCR 检测试剂盒说明书中的反应程序对不同浓度的标准物质进行扩增反应，获得 Ct 值，以同一浓度标准物质的 Ct 值为纵坐标、浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，同时获得扩增效率 E 和相关系数 R2。 A.2.2.3.2 RT-qPCR 检测 采用双靶标基因检测，针对ORF1ab基因和N基因，必要时可根据检测需求和相关规定进行调整。将提取得到的核酸样本按照RT-qPCR试剂盒说明书进行扩增反应体系配制和扩增检测，每个核酸样本应取3份用于扩增检测，即做3个平行样本。
A.3 内标物检测 A.3.1 原理 以污水样本中存在的辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）为内标物，分别定量检测污水原液和经富集浓缩处理的污水样本中 PMMoV核酸浓度，其RT-qPCR检测与新冠病毒核酸RT-qPCR检测同批次进行，并做PMMoV核酸标准曲线定量，将核酸浓度换算为污水样本PMMoV核酸浓度，通过计算获得PMMoV核酸回收率。
A.3.2 试剂和材料 PMMoV核酸引物和探针如下。 正向引物（F）：5’-GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA-3’。 反向引物（R）：5’-TTGTCGGTTGCAATGCAAGT-3’。 荧光探针（P）：5’-FAM-CCTACCGAAGCAAATG-MGB-3’。 其他所需试剂和材料同A.1和A.2。
A.3.3 仪器和设备 仪器和设备同A.1和A.2。
A.3.4 检测步骤 A.3.4.1 富集浓缩 PMMoV核酸与新冠病毒核酸应同步进行富集浓缩，按照A.1的要求进行。 A.3.4.2 核酸提取 分别提取污水原液和污水富集浓缩液中的PMMoV核酸。提取污水原液（未经过富集浓缩的污水）用于测定PMMoV核酸浓度的试剂盒应含有微量助沉剂，或在提取时额外加入微量助沉剂（如捕获RNA、线性聚丙烯酰胺等）。应优先选择适用于污水等环境样本的核酸提取试剂盒；当浓缩液中存在大量杂质或浓缩液较黏稠时，应适当增加杂质漂洗次数。污水富集浓缩液中的PMMoV和新冠病毒同步进行核酸提取，提取操作参照核酸提取试剂盒说明书。 A.3.4.3 PMMoV 核酸标准曲线绘制 应使用有证的PMMoV核酸标准物质，按照A.2.2.3.1制备PMMoV核酸标准曲线。 A.3.4.4 RT-qPCR 检测 针对复制蛋白基因（R）采用单靶标基因检测。对污水原液和经富集浓缩处理的污水样本中PMMoV核酸分别按照RT-qPCR检测试剂盒说明书进行扩增反应体系配制和扩增检测，每个核酸样本应取3份用于扩增检测，即做3个平行样本。 A.3.4.5 PMMoV 核酸回收率计算 A.3.4.5.1 PMMoV 核酸浓度计算 将污水原液和污水富集浓缩液获得的核酸样本PMMoV核酸Ct值的平均值分别代入PMMoV核酸标准曲线，计算核酸样本中PMMoV核酸浓度。按式（A.1）计算污水原液中PMMoV核酸的浓度，按式（A.2）计算用污水富集浓缩液推算得到的污水样本中PMMoV核酸的浓度。 C 0 = C’× V’/𝐀0’··············· (A.1) 式中： C0——污水原液中PMMoV核酸浓度，单位为拷贝每毫升（copies/mL）； C’——经PMMoV核酸标准曲线计算得到的污水原液核酸样本中PMMoV核酸浓度，单位为拷贝每毫升（copies/mL）； V’——污水原液提取得到的核酸样本体积，单位为毫升（mL）； V0’——污水原液体积，单位为毫升（mL）。 C1 = C3×V4×V2/(V3×V1)············· (A.2) 式中： C1——用富集浓缩液推算得到的污水样本中PMMoV核酸浓度，单位为拷贝每毫升（copies/mL）； C3——经PMMoV核酸标准曲线计算得到的富集浓缩液核酸样本中PMMoV核酸浓度，单位为拷贝每毫升（copies/mL）； V4——提取核酸得到的核酸样本体积，单位为毫升（mL）； V2——富集浓缩液体积，单位为毫升（mL）； V3——提取核酸时所用的浓缩液体积，单位为毫升（mL）； V1——经富集浓缩处理的污水样本体积，单位为毫升（mL）。 A.3.4.5.2 PMMoV 核酸回收率计算 按式（A.3）计算污水样本PMMoV核酸回收率。 H = C1/C0×
100············································· (A.3) 式中： H ——PMMoV核酸回收率，%； C1——用富集浓缩液推算得到的污水样本中PMMoV核酸浓度，单位为拷贝每毫升（copies/mL）； C0——污水原液中PMMoV核酸浓度，单位为拷贝每毫升（copies/mL）。
A.4 质量控制要求 A.4.1 空白样本 空白样本检测结果为阴性，监测过程有效。 A.4.2 RT-qPCR反应 标准曲线的扩增效率E在90%～110%且相关系数R2≥0.99时，标准曲线有效。 A.4.3 PMMoV核酸回收率 PMMoV核酸回收率H≥5%时，检测过程有效。 |
鄂公网安备42011102005941号