污水中新型冠状病毒监测技术规范（WS/T 10042-2025）

A.1.3.3 仪器和设备

A.1.3.3.1 正压过滤器：有效过滤区域直径为 90 mm、100 mm 或 142 mm，耐压≥0.25 MPa。

A.1.3.3.2 蠕动泵：最大转速≥250 r/min。

A.1.3.3.3 气泵：可提供最大压力≥0.3 MPa。

A.1.3.3.4 微型瞬时离心机：配备 1.5 mL 或 2 mL 转子，可承受离心力≥2 000 g。

A.1.3.3.5 生物安全柜：II 级。

A.1.3.3.6 高压蒸汽灭菌器。

A.1.3.3.7 移液器：1 mL、50 mL。

A.1.3.3.8 冷冻离心机：4 ℃，50 mL 角转子，可承受离心力≥2 000 g。

A.1.3.4 富集浓缩步骤

A.1.3.4.1 超滤膜预处理

将超滤膜置于密封容器内，使用75%酒精浸泡活化过夜，经活化的超滤膜可于75%酒精内保存直至使用。

A.1.3.4.2 预离心

如果污水样本悬浮物含量过高，可采用低速离心去除较大的悬浮物后再进行后续富集。预离心会造成病毒损失，故在悬浮固体质量浓度≤400 mg/L的情况下不宜进行预离心处理，操作时可根据污水摇匀后是否有明显可见的大粒径颗粒物作为是否需要进行预离心的判定标准。预离心操作为：取适量污水样本在4 ℃ 2 000 g条件下离心2 min，留取上清液备用。离心机停止转动后应立即转移上清液，防止沉淀再次悬浮。剩余污水样本作为备份。

A.1.3.4.3 超滤浓缩

将A.1.3.4.1中活化的超滤膜光滑面朝上放置于正压过滤器内，确保超滤膜与过滤器紧密贴合并对正压过滤器进行密封固定，随后将正压过滤器与蠕动泵（或气泵）进行连接，应确保连接紧密。使用移液器将100 mL污水样本或预离心后的上清液转移至过滤器储液罐或200 mL烧杯内，启动蠕动泵并调节转速为200 r/min（或打开气泵，调节输出压力为0.2 MPa），直至观察到所有污水滤过超滤膜或等待15 min。由于超滤压力较大，为防止漏水漏气，连接过滤设备时应选择快插接头，并对软管连接处使用喉箍或扎带固定。

A.1.3.4.4 膜污染层回收

待超滤完成后，打开正压过滤器并取出超滤膜，使用刮刀收集超滤膜表面膜污染层，并用刮刀将其转移至事先装有0.8 mL氨丁三醇-乙二胺四乙酸缓冲液的1.5 mL或2 mL离心管内，用手振荡数次后瞬时离心，用镊子将刮刀从离心管中取出。此时离心管内液体即为该水样的病毒浓缩液，体积约为1 mL，于0 ℃～4 ℃条件下保存，并于24 h内完成核酸提取和RT-qPCR检测。离心管内分装的缓冲液体积可根据富集倍数的需要进行调整。

A.1.4 病毒核酸磁珠富集法

A.1.4.1 原理

向污水中加入经不同官能团修饰的磁珠，经修饰的磁珠通过电荷作用富集污水中经裂解后的病毒核酸片段，然后富集有病毒核酸的磁珠在外加磁场的作用下实现磁珠的定向迁移，从而完成污水中病毒核酸的快速富集。方法检出限为10¹ copies/mL浓度水平。

A.1.4.2 试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分子生物学级，配制试剂时使用无核酸酶的超纯水。

A.1.4.2.1 磁珠：表面经过修饰的羟基磁珠悬于缓冲液（50%异丙醇）。

A.1.4.2.2 裂解液：主要成分包括硫氰酸胍（6 mol/L）、缓冲剂[Tris（50 mmol/L）以及 EDTA（50 mmol/L）]、曲拉通 X-100（Triton X-100）（1% 体积分数），pH=6.5±0.1。

A.1.4.2.3 增强液：蛋白酶 K（20 mg/mL）、PBS 缓冲液[NaCl(137 mmol/L) KCl(2.7 mmol/L)Na₂HPO₄（4.3 mmol/L）KH₂PO₄（1.4 mmol/L）]，pH=7.3±0.1。

A.1.4.2.4 洗涤液：乙醇（80% 体积分数）、水。

A.1.4.2.5 洗脱液：Tris（10 mmol/L）、EDTA（1 mmol/L）、水，pH=8.0。

A.1.4.2.6 离心管：50 mL，无菌，材质为聚丙烯，可承受离心力≥2 000 g；1.5 mL、15 mL，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。

A.1.4.2.7 移液器吸头：200 μL，1 mL，带滤芯，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。

A.1.4.2.8 移液管：50 mL，无菌，材质为聚丙烯。

A.1.4.3 仪器和设备

A.1.4.3.1 冷冻离心机：4 ℃，50 mL 角转子，离心力≥3 000 g。

A.1.4.3.2 生物安全柜：II 级。

A.1.4.3.3 移液器：200 μL、1 mL、50 mL。

A.1.4.3.4 磁力架：规格为 15 mL 离心管。

A.1.4.3.5 振荡混匀仪。

A.1.4.3.6 水浴锅。

A.1.4.4 富集浓缩步骤

A.1.4.4.1 预离心

用移液器移取适量污水样本置于50 mL离心管中，在4 ℃ 2 000 g条件下离心2 min，留取上清液备用。剩余污水样本作为备份。

A.1.4.4.2 样本准备

用移液器转移8 mL上清液至15 mL离心管中，加入2 mL裂解液与100 μL增强液，将管盖拧紧，置于水浴锅中56 ℃孵育15 min。

A.1.4.4.3 磁珠添加

加入400 μL 20 mg/mL的磁珠（使用前充分重悬磁珠），通过反复倒置或者置于振荡混匀仪让磁珠在污水中充分混匀，转速为90 r/min，时长10 min。

A.1.4.4.4 结合和分离

磁珠与核酸结合后，将15 mL离心管放置在磁力架上，静置3 min，直至上清液澄清，使用移液器从离心管中吸出并弃除上清液。

A.1.4.4.5 洗涤

向离心管中加入1 mL洗涤液，轻轻吹打混匀，将磁珠悬液转移至1.5 mL离心管中，振荡混匀30 s。将1.5 mL离心管转移至磁力架上，静置2 min，弃除上清液。加入1 mL洗涤液，振荡混匀30 s，静置2 min，弃除上清液，室温下开盖静置5 min。

A.1.4.4.6 核酸洗脱

依据后续检测需求加入80 μL～200 μL洗脱液，振荡混匀30 s，置于水浴锅中65 ℃孵育6 min，将离心管放置在磁力架上，静置2 min，移取上清液至新的离心管中，得到病毒核酸浓缩液。于0 ℃～4 ℃条件下保存，并于24 h内完成RT-qPCR检测。

A.2 新冠病毒核酸检测

A.2.1 核酸提取

A.2.1.1 试剂和材料

A.2.1.1.1 病毒核酸提取试剂盒。实验室在首次使用和更换核酸提取试剂盒时应进行方法验证。

A.2.1.1.2 无核酸酶水：分子生物学级。

A.2.1.1.3 带盖离心管：1.5 mL，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。

A.2.1.1.4 移液器吸头：10 μL、100 μL、1 mL，带滤芯，无菌，无核酸酶，材质为聚丙烯。

A.2.1.1.5 其他材料：参照所用病毒核酸提取试剂盒说明书。

A.2.1.2 仪器和设备

A.2.1.2.1 生物安全柜：II 级。

A.2.1.2.2 高压蒸汽灭菌器。

A.2.1.2.3 移液器：10 μL、100 μL、1 mL。

A.2.1.2.4 其他仪器和设备：参照所用病毒核酸提取试剂盒说明书。

A.2.1.3 核酸提取步骤

在生物安全柜中打开装有污水样本或病毒浓缩液的离心管，按照病毒核酸提取试剂盒说明书规定的步骤，取适量污水样本或病毒浓缩液，采用手工或自动核酸提取仪进行核酸提取，提取完成后应立即封盖并马上进行RT-qPCR检测。应优先选择适用于污水等环境样本的核酸提取试剂盒；当病毒浓缩液中存在大量杂质或浓缩液较黏稠时，应适当增加杂质漂洗次数。剩余的病毒浓缩液和核酸样本应于-80 ℃条件下冻存。