发热伴血小板减少综合征防控方案

附件 2-2

发热伴血小板减少综合征实验室检测方案

为指导各级医疗机构、疾控机构和相关检测机构开展发热伴血小板减少综合征实验室检测工作，规范标本采集、运送、保存和检测程序，提高检测质量，制定本方案。

一、检测对象

发热伴血小板减少综合征疑似病例、临床诊断病例和确诊病例，媒介生物，宿主动物，环境标本等。

二、样本采集、保存和运输

（一）样本采集与保存。

1.病例血液样本。一般采集血清标本，也可为全血、血浆等。采集全血、血浆样本时，使用含抗凝剂（如 EDTA）的真空采血管，采集患者全血 3—5mL，采集后轻轻颠倒混匀 5—10 次，避免剧烈震荡；血浆应在采集全血后 1—2 小时内以 1500—2000 转/分钟离心 10—15 分钟，分离上层血浆；全血和血浆可短期（48小时内）保存在 2—8℃的冰箱中；血浆长期保存应分装保存于做好标记的、带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，保存于-70℃及以下冰箱（一周内检测可保存在-20℃冰箱）。采集血清样本时，用无菌真空干燥管采集患者急性期（发病后 1—2 周）和恢复期（一般发病后 2—4 周）非抗凝血标本 3—5mL，及时分离血清，根据需要分装保存于做好标记的、带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内。恢复期标本与急性期标本采集间隔应不少于 7 天。标记清楚后将血清保存于-70℃及以下冰箱（一周内检测可保存在-20℃冰箱）。可用于病毒特异性核酸、抗原和抗体检测及病原体分离。

2.蜱媒样本。蜱媒监测中捕获的蜱经初步分类后，按采集地点分组放入做好标记的、带螺旋盖、内有垫圈的离心管。已吸血的蜱可单独存放，每只一管；未吸血的蜱可根据不同目的分组存放，每 5 只一管。可用于病毒特异性核酸检测及病原体分离。

采集蜱媒样本时，采集者应穿防护服，扎紧领口、袖口、裤口，穿长筒白布袜，佩戴白色帽子及手套等。

3.宿主动物血液样本。可根据宿主动物的体型，采取直接抽取或用滤纸条（5cm×1cm）沾取等方式采集血标本。血液样本应及时分离血清，根据需要分装保存于做好标记的、带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内；滤纸条采集血标本后，阴干，装入带螺旋盖的冻存管，-20℃及以下冷冻保存待查。可用于病毒特异性核酸、抗原和抗体检测及病原体分离。

4.环境样本。用拭子采集环境样本和患者分泌物、呕吐物。将采集后的拭子标本放置在含有少量无菌盐水或磷酸盐缓冲液的无菌容器中，使用商业化的拭子时，标本保存液应适合用于病毒分离。其他体液标本采集后，应置于无菌容器内。以上标本均应低温保存和运输。可用于病毒特异性核酸检测及病原体分离。

（二）样本运输。

按照《人间传染的病原微生物目录》要求，发热伴血小板减少综合征病毒的危害程度属于第二类病原微生物，病毒培养物标本应按 A 类包装（编号：UN2814），其他标本应按 B 类包装（编号：UN3373）。样本运输时应遵守国家相关生物安全规定，采用低温运输，避免反复冻融。用于开展病原学监测的样本，应于 48小时内运送至地市级或省级疾控机构。

三、病例实验室检测

（一）病原学。

1.核酸检测。可采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）或其他经过评估合格的病毒基因组核酸检测方法进行检测，可用于早期诊断。

2.病毒培养分离。用于病毒培养分离的标本经处理后，接种至 Vero、Vero E6 等细胞或其他敏感细胞中进行病毒培养分离，可用 Real-time PCR、酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光等方法鉴定病毒种类。

3.基因测序。采用一代 Sanger 法或扩增子技术进行发热伴血小板减少综合征病毒基因组测序，测序技术经质控合格后，方可用于后续生物信息分析。优先选择与标准株、基因型明确以及分离日期和地区信息完整的病毒株基因组序列进行比较分析。二代测序平台覆盖深度应不低于 10×，三代测序平台覆盖深度应不低于 50×，全基因组测序覆盖度应不低于 98%。

各地根据疫情形势开展病毒全基因组序列测定和分析，优先选取本地首例病例、指示病例、重型病例和死亡病例等。当年有病例报告的县（区），病例数少于 20 例时，至少选取 1 例开展病毒全基因组测序分析；病例数达 20 例及以上时，病毒全基因组测序分析量应不低于 5%；发生聚集性疫情时，应增加病毒全基因组序列测定和分析的样本数，对用于查明疫情性质和波及范围的聚集性病例应检尽检。不具备基因测序条件的县级疾控机构，应将样本送至地市级或省级疾控机构进行检测。

（二）血清学。

1.特异性 IgM 抗体。采用 ELISA、免疫层析等方法检测，IgM抗体阳性表明近期可能受到感染，可用作临床诊断。

2.特异性 IgG 抗体。采用 ELISA、免疫荧光（IFA）、免疫层析以及中和试验等方法检测，IgG 抗体阳性表明曾受到病毒感染。患者恢复期血清 IgG 抗体阳转或滴度较急性期呈 4 倍及以上升高者可确诊。

3.特异性总抗体。可采用双抗原夹心 ELISA 法检测，血清特异性总抗体阳性表明曾受到病毒感染。

四、实验室生物安全

发热伴血小板减少综合征病毒属于第二类病原微生物，具有较高致病性，涉及感染性样本的操作，如病毒培养分离、未经培养的阳性或疑似阳性样本的灭活、检测等需在生物安全二级（BSL-2）或以上防护级别的实验室开展。动物感染实验在动物生物安全三级（ABSL-3）实验室开展。灭活后的样本核酸检测，可在相应的专门区域或实验室进行，严格按照分区操作原则操作。实验室个人防护应按照相应实验室生物安全防护等级要求执行。