分枝杆菌消毒效果评价方法（WS/T 10054—2026）

4.2.2 模拟现场试验

4.2.2.1 物体表面模拟现场消毒试验，用于验证消毒剂、产生化学消毒因子的消毒器械对人工污染于载体表面分枝杆菌的消毒效果，其操作程序应按 5.3.2.3 进行。

4.2.2.2 内镜模拟现场消毒试验，用于验证内镜消毒剂和清洗消毒机对人工污染于模拟内镜分枝杆菌的消毒效果，应按 GB/T 38497 进行。

5 评价方法

5.1试验器材

5.1.1 试验菌株

龟分枝杆菌脓肿亚种 CMCC（B）93326或ATCC 19977。

5.1.2 培养基

5.1.2.1 营养肉汤培养基（见附录 A）。

5.1.2.2 苏通综合液体培养基（见附录 A）。

5.1.2.3 改良罗氏培养基（见附录 A）。

5.1.2.4 商品化分枝杆菌培养基，按产品说明书储存并在有效期内使用。

5.1.3 有机干扰物

5.1.3.1 有机干扰物包括牛血清白蛋白（BSA）或胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB），见附录 A。

5.1.3.2 用于经过清洗或较清洁的消毒对象的消毒剂悬液定量杀菌试验使用 0.3% BSA；用于不经过清洗或较脏的消毒对象的消毒剂悬液定量杀菌试验使用 3.0% BSA。

5.1.3.3 载体浸泡定量杀菌试验使用 TSB。

5.1.4 其他试剂

5.1.4.1 中和剂：根据消毒剂种类选择并经中和剂鉴定试验（见附录 B）合格者。

5.1.4.2 稀释液：胰蛋白胨生理盐水溶液（TPS）（见附录 A）。

5.1.4.3 标准硬水（见附录 A）。

5.1.5 仪器设备

5.1.5.1 恒温培养箱。

5.1.5.2 恒温水浴箱或恒温金属浴。

5.1.5.3 计时器。

5.1.5.4 电动混匀器。

5.1.5.5 刻度吸管（0.1 mL，1.0 mL，5.0 mL）或移液器及配套吸头。

5.1.5.6 Ⅱ级生物安全柜。

5.2菌悬液和染菌载体的制备

5.2.1 菌悬液的制备

5.2.1.1 以无菌操作方式开启冻干菌种管，用毛细吸管吸加适量培养液（营养肉汤或苏通综合液体培养基）于管中，吹吸数次，使菌种溶化分散。取含 5.0 mL～10.0 mL 培养液的试管，滴入少许菌种悬液，置 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于分枝杆菌培养基（改良罗氏培养基或其他商品化分枝杆菌培养基）平板上，于 36 ℃±1 ℃培养 72 h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于分枝杆菌培养基斜面，于 36 ℃±1 ℃培养 72 h，即为第 3 代培养物。密封后，4 ℃保存，时间不超过 6 周。

5.2.1.2 试验时，取第 3 代斜面培养物在分枝杆菌培养基斜面上按上述方法连续传代，取第 5 代～第6 代的分枝杆菌培养基斜面 72 h 培养物，用 5.0 mL 吸管吸取 3.0 mL～5.0 mL 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。用吸管将洗液移至另一含有适量玻璃珠（直径约 6 mm）的无菌圆锥底塑料试管中，用电动混匀器混合 5 min，将菌液吸入到另一试管内制成菌悬液。

5.2.1.3 菌悬液保存在 4 ℃冰箱内备用，当天使用，不应过夜。

5.2.2 染菌载体的制备

5.2.2.1 载体

5.2.2.1.1 应根据消毒对象选择相应的材料为载体。常用的材料有金属、玻璃、滤纸、棉布、聚四氟乙烯等，载体通常为方形，大小 10 mm×10 mm。金属载体一般用 12 mm 直径圆形金属片（厚 0.5 mm），特定用途的消毒产品可使用其他材质、形状的载体。

5.2.2.1.2 所用载体（除滤纸片外）于染菌前，应进行脱脂处理。脱脂方法如下：

a) 将载体放在含洗涤剂的水中煮沸 30 min；

b) 以自来水洗净；

c) 用蒸馏水煮沸 10 min；

d) 用蒸馏水漂洗至 pH 呈中性；

e) 晾干、展平备用。

5.2.2.1.3 布片用 40 织纱的白平纹棉布制作。将脱脂后的布块按载体规定的大小抽去边缘一周的经纬纱各一根，按抽纱痕剪开。金属片以不锈钢制作，纸片以新华定性滤纸制作，用于内镜消毒的模拟内镜以聚四氟乙烯制作，按照 GB 38497 进行。

5.2.2.1.4 载体经压力蒸汽灭菌后，使用滴染法染菌。

5.2.2.2 染菌载体

取上述5.2.1.2所获得的菌悬液，用TSB将菌悬液稀释成浓度约为5×10⁸CFU/mL。滴染法染菌时，将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，用移液器逐片滴加菌液10μL，必要时用接种环涂匀整个载体表面。如使用布片载体等渗透性材质载体，用镊子夹取载体一角滴染菌液，待菌液均匀扩散后，置于平皿内。置36 ℃±1 ℃恒温培养箱或室温干燥备用。每个染菌载体的活菌培养计数结果回收菌数应满足1×10⁶CFU/片～5×10⁶CFU/片。

5.3试验方法

5.3.1 试验分组

5.3.1.1 试验组：实验室试验中，选定产品使用说明书指定的最低浓度及 3 个作用时间（说明书指定最短作用时间，指定最短作用时间的 0.5 倍，指定最短作用时间的 1.5 倍）进行试验。模拟现场试验中，根据使用说明书，选择最低浓度及最短作用时间或指定程序进行试验。

5.3.1.2 阳性对照组：以标准硬水代替消毒剂溶液，按照试验组相同步骤进行试验。所得结果代表试验体系中所含受试菌的初始浓度﹐以其作为对照组活菌浓度。

5.3.1.3 阴性对照组：观察同次试验用相关试剂和培养基有无污染。