分枝杆菌消毒效果评价方法（WS/T 10054—2026）

附 录 B

（规范性）

中和剂鉴定试验方法

B.1 目的

确定所选中和剂是否适用于拟进行的分枝杆菌杀灭试验。

B.2 试验设计原则

B.2.1 试验中所用的消毒剂浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。

B.2.2 所用试验方法应与杀菌试验方法一致，相应使用悬液或载体定量试验。

B.3 试验分组

至少应平行进行以下各组试验。

a) 中和剂＋菌悬液或染菌载体→培养观察中和剂是否抑菌。

b) （消毒剂＋中和剂）＋菌悬液或染菌载体→培养观察中和产物和未被完全中和的残留消毒剂对试验分枝杆菌是否有抑菌作用。

c) 稀释液＋菌悬液或染菌载体→培养作为菌悬液或染菌载体阳性对照。

d) 稀释液＋中和剂→培养作为试验材料阴性对照。

B.4 操作程序

B.4.1 中和剂悬液定量鉴定试验程序

根据试验分组，准备足量的试管和平皿，并依次进行编号。将菌悬液用等量适用浓度的有机干扰物稀释成2.5×10³CFU/mL～1.5×10⁴CFU/mL，作为试验菌悬液。鉴定试验包括四组：

第一组 取0.4 mL标准硬水于试管中，加入4.5 mL中和剂，混匀，置20 ℃±1 ℃的水浴或金属浴中5 min后，加入0.1 mL菌悬液，混匀，作用10 min后，分别取1.0 mL接种两个平皿，做活菌培养计数。

第二组 取0.4 mL消毒剂于试管中，加入4.5 mL中和剂（对于酸性氧化电位水检测时，取0.5 mL消毒剂于试管内，加入4.4 mL中和剂），混匀，置20 ℃±1 ℃的水浴或金属浴中5 min后，加入0.1 mL菌悬液，混匀，作用10 min后，分别取1.0 mL接种两个平皿，做活菌培养计数。

第三组 取0.4 mL标准硬水于试管，加入4.5 mL稀释液，混匀，置20 ℃±1 ℃的水浴或金属浴中5 min后，加入0.1 mL菌悬液，混匀，作用10 min后，分别取1.0 mL接种两个平皿，做活菌培养计数。

第四组 取标准硬水、稀释液、中和剂各1.0 mL，接种于同一无菌平皿，倾入试验同批次的培养基15 mL～20 mL，培养观察。

B.4.2 中和剂载体定量鉴定试验操作程序

根据试验分组，准备足量的试管和平皿，并依次进行编号。将菌悬液用等量适用浓度的有机干扰物稀释，然后取10μL滴染无菌载体，于36 ℃±1 ℃培养箱或室温自然干燥。使载体试验回收菌量在2.5×10²CFU/片～1.5×10³CFU/片之间。鉴定试验包括四组。

——第一组 取5.0 mL中和剂于试管中，置20 ℃±1 ℃的水浴或金属浴中5 min后，用无菌镊子取1片染菌载体放入试管中，并使浸透于中和剂内，作用10 min。用电动混匀器混合20 s或将试管振打80次，混匀，分别取1.0 mL接种两个平皿，做活菌培养计数。

——第二组 取5.0 mL中和产物溶液（按每片浸有消毒剂的载体加入5.0 mL中和剂量制备中和产物，作用10 min）于试管中，置20 ℃±1 ℃的水浴或金属浴中5 min后，用无菌镊子取1片染菌载体放入试管中，并使浸透于中和产物溶液中，作用10 min。用电动混匀器混合20 s或将试管振打80 次，混匀，分别取1.0 mL接种两个平皿，做活菌培养计数。

——第三组 取5.0 mL稀释液于试管中，置20 ℃±1 ℃的水浴或金属浴中5 min后，用无菌镊子取1片染菌载体放入试管中，并使浸透于稀释液中，作用10 min。用电动混匀器混合20 s或将试管振打80次，混匀，分别取1.0 mL接种两个平皿，做活菌培养计数。

——第四组 分别吸取稀释液和中和剂各1.0 mL，接种于同一无菌平皿，倾入试验同批次的培养基15 mL～20 mL，培养观察。

B.5 评价规定

B.5.1 第一、二，三组有相似菌量生长，悬液试验作用体系中菌量在50 CFU/mL～300 CFU/mL之间，载体试验菌量在2.5×10²CFU/片～1.5×10³CFU/片之间，且组间菌落数误差率不应超过15%。组间菌落数误差率（%）按式（B.1）计算：

𝑃_𝑍 =∑|𝑋−𝑋𝑖| / ∑^𝑋𝑖×100%··································(B.1)

式中：

Pz——组间菌落数误差率，%；

X——三组间菌落平均数；

Xi——各组菌落平均数，单位为菌落形成单位（CFU）。

B.5.2 第四组无菌生长。否则应更换试剂，重新试验。

B.5.3 试验重复3次，结果符合以上要求的，判定所选中和剂合格。

B.6 注意事项

B.6.1 试验所分各组均有其特定意义，不得任意删减。

B.6.2 无菌操作，保持试验用液和器材的无菌，注意更换吸管，保证试验的准确性。

B.6.3 试验组序应按本文件执行。

B.6.4 中和剂鉴定试验应根据正式杀灭试验进行选择（或设计），悬液鉴定试验结果可用于载体试验，载体鉴定试验结果不可用于悬液试验。

参考文献

[1] GB/T 30690 小型压力蒸汽灭菌器灭菌效果监测方法和评价要求

[2] WS 233 病原微生物实验室生物安全通用准则

[3] WS 628 消毒产品卫生安全评价技术要求

[4] WS/T 10009 消毒产品检测方法

[5] YY 1277 压力蒸汽灭菌器 生物安全性能要求