分枝杆菌消毒效果评价方法（WS/T 10054—2026）

5.3.2 试验操作程序

5.3.2.1 悬液定量杀灭试验

5.3.2.1.1 按产品说明书要求配制消毒液。无特殊说明者，使用标准硬水将消毒剂配制成试验浓度的1.25 倍，置 20 ℃±1 ℃水浴或金属浴 5 min 备用。

5.3.2.1.2 取上述 5.2.1.2 所获得的菌悬液，配制浓度为 1×10⁷CFU/mL～5×10⁷CFU/mL，试验前与牛血清白蛋白（BSA）等体积混合成试验用菌悬液（回收菌落数为 1×10⁶CFU/mL～5×10⁶CFU/mL）。

5.3.2.1.3 取消毒试验用无菌试管，加入 1.0 mL 含有 BSA 的菌悬液，置 20 ℃±1 ℃水浴或金属浴中5 min 后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 mL 注入其中，迅速混匀并立即计时。待试验菌与消毒剂相互作用至各设定时间，分别吸取 0.5 mL 试验菌与消毒剂混合液加于 4.5 mL 中和剂中，混匀。各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用 10 min 后，分别吸取 1.0 mL 样液，按 5.3.2.5 进行活菌培养计数。

5.3.2.1.4 同时用标准硬水代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。分别吸取稀释液与中和剂各1.0 mL 于无菌平皿内，倾入上述试验同批次的培养基 15 mL～20 mL，作为阴性对照样本。

5.3.2.1.5 根据活菌培养计数结果，按照 5.3.3 计算杀灭对数值。

5.3.2.1.6 试验重复 3 次。

5.3.2.2 载体浸泡定量杀灭试验

5.3.2.2.1 取无菌平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片染菌载体 5.0 mL 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中（吸管不易吸取的粘稠消毒剂可直接用无菌平皿按每片 5 g 的量称取样品）。置20 ℃±1 ℃水浴或金属浴 5 min 备用。

5.3.2.2.2 用无菌镊子取预先制备的染菌载体 3 片分别放入平皿中，并使之浸没于消毒液，待消毒作用至各预定时间，用无菌镊子将染菌载体取出分别移入含 5.0 mL 中和剂的试管中。用电动混匀器混合20 s，或将试管在手掌上振打 80 次。中和作用 10 min。混匀后，吸取 1.0 mL 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，按 5.3.2.5 进行活菌培养计数。

5.3.2.2.3 同时用标准硬水代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。分别吸取稀释液与中和剂各1.0 mL 于无菌平皿内，倾入上述试验同批次的培养基 15 mL～20 mL，作为阴性对照样本。

5.3.2.2.4 根据活菌培养计数结果，按照 5.3.3 计算杀灭对数值。

5.3.2.2.5 试验重复 3 次。

5.3.2.3 物体表面模拟现场消毒试验

5.3.2.3.1 按产品使用说明书要求，选择合适的的密闭空间进行模拟现场消毒试验。

5.3.2.3.2 试验组：在 BSL-2 实验室内的生物安全柜中，采用无菌操作方式，用无菌镊子取预先制备的染菌载体至少 10 片分别放入无菌平皿中，按 GB 19489 要求进行包装和运送，在现场选择相对分布均匀、包含最难消毒位置的至少 10 个点位放置平皿，采用无菌操作方式打开平皿盖，按产品使用说明书要求进行消毒。待消毒作用至预定时间，收集所有点位的无菌平皿，按 GB 19489 要求进行包装并运送回 BSL-2 实验室，在生物安全柜中用无菌镊子将染菌载体取出，移入含 5.0 mL 中和剂的试管中，电动混匀器混合 20 s，或将试管在手掌上振打 80 次。

5.3.2.3.3 阳性对照：取 2 片染菌载体，放置与试验组相同时间，作为阳性对照。

5.3.2.3.4 阴性对照：吸取稀释液 1.0 mL 于无菌平皿内，倾入上述试验同批次的培养基 15 mL～20 mL。

5.3.2.3.5 所有试验样本均按 5.3.2.5 进行活菌培养计数。

5.3.2.3.6 根据活菌培养计数结果，按照 5.3.3 计算杀灭对数值。

5.3.2.3.7 试验重复 3 次。

5.3.2.4 内镜模拟现场消毒试验

用于内镜消毒的消毒剂和清洗消毒机，分枝杆菌内镜模拟现场消毒试验操作流程和结果判定按照GB/T 38497进行。

5.3.2.5 活菌培养计数

平皿倾注法：取1.0 mL分枝杆菌悬液（或染菌载体洗脱液）的适宜稀释倍数稀释液，加于灭菌平皿中，倾注经加热融化并冷却到45 ℃～50 ℃的培养基，每皿约15 mL～20 mL，旋转混匀。待冷却凝固后，放入干净的塑料袋内，36 ℃±1 ℃培养箱培养7 d，观察并计数菌落数。

5.3.3 杀灭对数值的计算

计算各组的活菌浓度（CFU/mL），并换算为对数值（N），然后按式（1）计算杀灭对数值（KL）。

𝐾𝐿 = 𝑁_𝑂 − 𝑁_𝑋 ·····································(1)

式中：

KL——杀灭对数值；

N_O——对照组平均活菌浓度的对数值；

N_X——试验组活菌浓度对数值。

计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可进行数字修约。如消毒试验组平均生长菌落数小于1时，规定此时的杀灭对数值，即为大于或等于对照组平均活菌浓度的对数值（KL≥No）。

6 评价规定

6.1试验回收菌量要求

6.1.1 悬液定量杀灭试验，回收菌量为 1×10⁶CFU/mL～5×10⁶CFU/mL；

6.1.2 载体定量浸泡杀灭试验，回收菌量为 1×10⁶CFU/片～5×10⁶CFU/片。

6.2试验结果判定

6.2.1 用悬液定量杀灭试验评价杀菌效果时，在产品规定使用最低浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的 1.5 倍时，各次试验的杀灭对数值均应大于或等于 4.00，可判定该产品对分枝杆菌消毒合格。

6.2.2 用载体浸泡定量杀灭试验评价杀菌效果时，在产品规定使用浓度与最短作用时间和最短作用时间的 1.5 倍时，各次试验的杀灭对数值应大于或等于 3.00，可判定该产品对分枝杆菌消毒合格。

6.2.3 用物体表面模拟现场消毒试验评价杀菌效果时，在产品规定使用浓度与最短作用时间时，各次试验的所有样本杀灭对数值应大于或等于 3.00，可判定该产品对分枝杆菌消毒合格。

7 注意事项

7.1试验菌株的培养物和染菌载体的实验操作应在生物安全柜内进行，转运时应采用符合要求的包装材料密闭转运，并在灭菌后按医疗废物处理。

7.2试验人员应佩戴个人防护装备，注意无菌操作。

7.3实验室应有菌株意外泄漏时的应急预案和标准操作流程，发生意外泄露时应按 GB 19489 处理。