钩端螺旋体病诊断标准（WS 290—2026 ）

附 录 A

（规范性）

钩端螺旋体病原学检查

A.1 临床样本显微镜检查

A.1.1 患者血液直接镜检

A.1.1.1 取早期患者血液一滴，加蒸馏水一滴，使血细胞溶解，在暗视野显微镜下检查有无活动的钩端螺旋体。

A.1.1.2 取早期患者静脉血 1 mL～2 mL 于无菌试管中静置凝固，离心沉淀，吸取血清与血细胞交界处略显白色的悬液，置于载玻片上，在暗视野显微镜下检查有无活动的钩端螺旋体。

A.1.1.3 采集早期患者静脉血 1 mL，加于含 2 mL 枸橼酸钠盐水管中，1000 r/min 离心 10 min，吸上层血浆置另一清洁管中，3000 r/min～3500 r/min 离心 30 min～60 min。弃上清，取沉淀物一滴于载玻片上，用暗视野显微镜检查有无活动的钩端螺旋体。

A.1.2 患者尿液直接镜检

无菌采集患者尿液，取一滴尿液置于载玻片上，加盖玻片，在暗视野显微镜下检查有无活动的钩端螺旋体。

A.2 细菌分离培养

A.2.1 患者血液培养

血培养应在发病最初10 d内并在使用抗生素治疗前进行。无菌操作取患者血液100 μL～200 μL，接种到5 mL～10 mL Korthof或EMJH（Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris）等适宜培养基中，平行接种2管～3管，在28℃培养，每隔5 d～7 d取培养物在暗视野显微镜下观察有无一端或两端弯曲成钩状、菌体呈现问号状、C或S形态的螺旋体生长，若有生长，可进一步开展鉴定。若未见生长，应继续培养60 d，仍不见生长方做阴性处理。

A.2.2 患者尿液培养

采集发病1 周后的患者中段尿30 mL～50 mL于无菌离心管中，以10000 r/min离心1 min。取沉渣0.5mL接种于第一管5 mL Korthof或EMJH培养基中，混匀后吸0.5 mL接种于第二管5 mL培养基中，混匀后吸0.5 mL接种于第三管5 mL培养基中。平行接种2管～3管，在28℃培养，每隔5 d～7 d取培养物在暗视野显微镜下观察有无一端或两端弯曲成钩状、菌体呈现问号状、C或S形态的螺旋体生长，若有生长，可进一步开展鉴定。若未见生长，应继续培养60 d，仍不见生长方做阴性处理。为提高检出率和减少污染，可在培养基中加入100μg/mL～400 μg/mL 5-氟脲嘧啶。尿液标本应在留尿2 h内完成接种。

A.2.3 患者脑脊液培养

脑脊液培养应在发病最初10 d内进行。对有脑膜刺激和其他神经系统症状的患者，腰椎穿刺获取脑脊液，取0.5 mL脑脊液接种于5 mL Korthof或EMJH培养基中，平行接种2管～3管，在28℃培养，每隔5 d～7 d取培养物在暗视野显微镜下观察有无一端或两端弯曲成钩状、菌体呈现问号状、C或S形态的螺旋体生长，若有生长，可进一步开展鉴定。若未见生长，应继续培养60 d，仍不见生长方做阴性处理。

A.2.4 动物接种培养

取患者血液或脑脊液0.5 mL～1 mL或尿液2 mL接种金黄地鼠（体重20 g～50 g）或幼龄豚鼠（体重120 g～200 g）下腹两侧皮下或者腹腔，进行发病观察，一周后取心血暗视野显微镜下观察以及进行钩端螺旋体分离。

A.3 钩端螺旋体菌株鉴定

A.3.1 显微镜凝集试验（Microscopic agglutination test；MAT）

A.3.1.1 操作步骤

待检菌株需提前在暗视野显微镜下检查，要求每400倍视野下不少于100条～200条，运动活泼并无自凝。将我国15群15型标准菌株免疫家兔获得的诊断血清，56℃水浴灭活30 min后，用生理盐水以1∶50开始稀释，稀释到1∶6 400。不同稀释度各血清群诊断血清、阳性对照（相应标准菌株）及空白对照生理盐水各取50 μL加入各反应孔中。分别取待检分离株培养液50 μL加入上述稀释度血清及对照中。摇匀后37℃孵育1 h。取反应液及对照，放置载玻片上暗视野显微镜下观察凝集情况。凝集滴度按原血清稀释倍数×2计算。

A.3.1.2 终点凝集滴度的判定

以出现＋＋凝集(即视野中50％钩端螺旋体被凝集)的群血清最高稀释度作为终点凝集滴度，确定所属血清群。

A.3.2 核酸检测

可疑菌株进行核酸检测，检出钩端螺旋体特异性核酸可判定为钩端螺旋体菌，见C.1和C.2。