钩端螺旋体病诊断标准（WS 290—2026 ）

附 录 C

（规范性）

钩端螺旋体核酸检测

C.1 聚合酶链式反应（PCR）检测钩端螺旋体特异基因

C.1.1 目标基因

从临床标本和分离培养的菌株中检测钩端螺旋体核酸时，通常以secY和flaB作为目标基因，flaB基因用来检测L. kirschneri致病性钩端螺旋体，secY基因检测其他常见的致病性钩端螺旋体，也可选择其他特异性基因。

C.1.2 参考引物序列

参考引物序列见表C.1。

表C.1 PCR用参考引物序列

C.1.3 模板制备

临床标本和已经分离培养的菌株使用商品化基因组DNA提取试剂盒，具体操作方法按试剂盒说明进行。

C.1.4 PCR反应体系

一次总量25 μL的反应体系如表C.2所示。

表C.2 PCR 反应体系中的成分及加样量

反应设立质控参数：使用纯水作为阴性对照，用已知致病性钩端螺旋体菌模板作为阳性对照。加样顺序：首先加入阴性对照，然后加待测模板，最后加入阳性对照。

C.1.5 PCR扩增

95℃预变性5 min，1个循环； 94℃变性60 s， 55℃退火60 s， 72℃延伸90 s，35个循环；最后72℃ 延伸10 min。

C.1.6 PCR扩增产物的检测分析

PCR 产物各取5 μL加入1%琼脂糖凝胶的加样孔内（不含染料的mix需要加入1μL上样缓冲液），加入Marker 5 μL，5 V/cm电泳40 min观察条带。

PCR产物也可进行测序分析。

C.1.7 结果判读

在紫外透射仪或凝胶成像系统中观察结果，当阴性对照和阳性对照成立时，如钩端螺旋体靶基因扩增出现预期条带，则表明检测标本阳性。当阴性对照和阳性对照不成立时，需要重新进行检测。测序结果与钩端螺旋体菌特异基因序列匹配，表明标本阳性。

C.2 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Time PCR）检测钩端螺旋体特异基因

C.2.1 目标基因

从临床标本和分离培养的菌株检测钩端螺旋体时，以钩端螺旋体16S rRNA基因和LipL32基因作为目标基因，也可选择其他特异性基因。

C.2.2 试剂选择

可使用商品化试剂盒，按照操作说明书进行操作，也可按照本标准第C.2.3条～C.2.7条进行。

C.2.3 参考引物和探针序列

16S rRNA基因和LipL32基因参考引物和探针序列见表C.3。

表C.3 Real-Time PCR引物和探针具体信息

C.2.4 模版制备

同C.1.3。

C.2.5 Real-Time PCR反应体系

一次总量20 μL的Real-Time PCR反应体系见表C.4。

表C.4 Real-Time PCR 反应体系中的成分及加样量

反应设立质控参数：使用纯水作为阴性对照，用已知致病性钩端螺旋体菌模板作为阳性对照。加样顺序：首先加入阴性对照，然后加待测模板，最后加入阳性对照。

C.2.6 Real-Time PCR扩增

一般使用两步法进行扩增，参考程序如下： 95℃预变性10 s，1 个循环； 扩增反应：95℃ 5 s，60℃ 45 s，40个循环。不同的荧光定量 PCR 仪扩增的程序会有一些差异，可根据所使用的仪器对反应程序进行适当调整。

C.2.7 结果判定

当阴性对照和阳性对照成立时，16S rRNA基因和LipL32两个靶基因均Ct值小于35时判断为阳性，单基因或者双基因35≤Ct值＜37时结果可疑，需重新采集样本重新检测，16S rRNA基因和LipL32两个靶基因均Ct值大于或等于37或没有峰值时判断为阴性。当阴性对照和阳性对照不成立时，需要重新进行检测。若采用商品化试剂盒，结果判断依据参照试剂盒说明书操作。