5 分析步骤 5.1 凯氏定氮法 5.1.1 试样制备 液态样品摇匀;含有气体的蛋白饮料应采用超声波的方式脱气后再称量测定;基质均匀的半固态样品和粉状样品直接称量;其他样品需匀浆或粉碎均匀。粮食类样品至少要研磨200g样品。颗粒、块状固体样品研磨后要充分混匀,使其完全通过0.9mm(20目)孔径的筛子。产品标准中对样品处理有特殊要求的,按产品标准执行。制备好的试样应尽快测定。 5.1.2 水分测定 如试样结果以干基计算,应按照 GB5009.3或相应产品标准中规定的方法测定水分。 5.1.3 试样处理 称取固体试样0.2g~2g、半固体试样2g~5g,(精确至0.001g),液体试样10mL(g)~25mL(g)(相当于30mg~40mg氮),分别移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中,加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸,轻摇后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45°角斜放置于有小孔的石棉网上。缓慢加热,待内容物全部碳化,泡沫完全停止后,加大火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色并澄清透明后,再继续加热0.5h~1h。取下定氮瓶冷却至室温,小心加入 20 mL 水,将内容物全部转移至100mL容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶内壁,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用。同时进行空白试验。 5.1.4 测定 按附录 A 装好定氮蒸馏装置,向水蒸气发生器内装水至2/3处,加入数粒玻璃珠,加甲基红数滴及数毫升硫酸,至溶液成红色,以保持水呈酸性,加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。 向接收瓶内加入10.0mL 硼酸溶液及3滴~4滴 A 混合指示剂或 B混合指示剂,并使冷凝管的下 端插入液面下,根据试样中氮含量,准确吸取2.0mL~10.0 mL 试样处理液由小玻杯注入反应室,以10mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内,随后塞紧棒状玻塞。将10.0 mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯,提起玻塞使其缓缓流入反应室,立即将玻塞盖紧,并水封。夹紧螺旋夹,开始蒸馏。蒸馏15min后移动蒸馏液接收瓶,液面离开冷凝管下端,再蒸馏约1min,至用pH 试纸检测馏出液为中性。用少量水冲洗冷凝管下端外部,取下蒸馏液接收瓶。尽快以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点,如用 A 混合指示液,终点颜色为紫红色;如用 B混合指示液,终点颜色为浅灰红色。 5.2 全自动或半自动凯氏定氮仪法 称取固体试样0.2g~2g、半固体试样2g~5g,(精确至0.001g),液体试样10g(mL)~25g(mL)(相当于30mg~40mg氮),再加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸于消化炉进行消化。当消化炉温度达到420℃之后,继续消化至少1h,此时消化管中的液体呈绿色透明状,于全自动或半自动凯氏定氮仪(使用前根据不同仪器优化分析参数,加入氢氧化钠溶液,盐酸或硫酸标准溶液以及含有混合指示剂 A 或 B的硼酸溶液)进行试样检测。 当蛋白质含量≤1g/100g或1g/100mL时,建议使用0.05mol/L的标准滴定液滴定,当蛋白质含量>1g/100g或1g/100mL时,建议使用0.10mol/L的标准滴定液滴定。 注:当蛋白质含量过低且滴定体积小于1mL或蛋白质含量过高导致滴定体积大于自动凯氏定氮仪滴定管体积时,可调整称样量以减小滴定误差。当样品脂肪含量过高或糖含量过高时,可调整称样量以减小或避免消化时出现爆沸、喷溅、溢流的情况。 6 分析结果的表述 试样中蛋白质的含量按式(1)进行计算: X =(V1 -V2)×c×0.0140/（m
×V3/V4）×F ×100 …………………………(1) 式中: X ——试样中蛋白质的含量,单位为克每百克或克每百毫升(g/100g或g/100mL); V1 ——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,单位为毫升(mL); V2 ——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,单位为毫升(mL); C ——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度,单位为摩尔每升(mol/L); 0.0140——1.0mL硫酸[ c(1/2 H2SO4)÷=1.000mol/L]或盐酸[c (HCl)=1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量,单位为克每毫摩尔(g/mmoL); m ——试样的质量,单位为克或毫升(g或 mL); V3 ——吸取消化液的体积,单位为毫升(mL); V4 ——消解溶液的定容体积,单位为毫升(mL); F ——蛋白质折算系数(见附录 C); 100 ——由g/g转化为g/100g的换算系数。 蛋白质含量≥1g/100g或1g/100mL 时,结果保留三位有效数字;蛋白质含量<1g/100g 或1g/100mL 时,结果保留两位有效数字。 注1:分析结果以氮含量表述时,不需要乘蛋白质折算系数F。分析结果以蛋白质含量表述时,应同时报告蛋白质折算系数。 注2:当用半自动或全自动凯氏定氮仪全部转移消化液时,V3=V4。 注3:以干基计算试样中蛋白质的含量需根据试样的水分含量折算。 7 精密度 当样品中蛋白质含量≤10g/100g或10g/100mL,在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 当样品中蛋白质含量>10g/100g或10g/100mL,在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。 8 其他 当用0.05mol/L盐酸滴定液时,称样量为5.0g或5.0mL,本方法对氮的检出限为0.008g/100g或 0.008g/100mL。 第二法 分光光度法 9 原理 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm 下测定吸光度值,与标准曲线比较定量,结果乘以换算系数,即为蛋白质含量。 10 试剂和材料 除非另有规定,本方法中所用试剂均为分析纯,水为 GB/T6682规定的三级水。
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