10.1 试剂 10.1.1 硫酸铜(CuSO4·5H2O)。 10.1.2 硫酸钾(K2SO4)。 10.1.3 氢氧化钠(NaOH)。 10.1.4 对硝基苯酚(C6H5NO3)。 10.1.5 乙酸钠(CH3COONa·3H2O)。 10.1.6 无水乙酸钠(CH3COONa)。 10.1.7 硫酸(H2SO4):98%。 10.1.8 乙酸(CH3COOH)。 10.1.9 甲醛(HCHO):37%。 10.1.10 乙酰丙酮(C5H8O2)。 10.1.11 乙醇(C2H5OH):95%。 10.1.12 硫酸铵[(NH4)2SO4]:优级纯。 10.2 试剂的配制 10.2.1 氢氧化钠溶液(300g/L):称取30g氢氧化钠加水溶解后,放冷,并稀释至100mL。 10.2.2 对硝基苯酚指示剂(1g/L):称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20mL95%乙醇中,加水稀释至100mL。 10.2.3 乙酸溶液(1mol/L):量取5.8mL 乙酸,以水稀释至100mL。 10.2.4 乙酸钠溶液(1mol/L):量取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠,溶于水并稀释至500mL。 10.2.5 乙酸钠-乙酸缓冲溶液:量取60mL 乙酸钠溶液与40mL 乙酸溶液混合,该溶液pH 为4.8。 10.2.6 显色剂:分别量取15 mL 甲醛与7.8 mL 乙酰丙酮,混合后以水稀释至100 mL,剧烈振摇混匀,4 ℃条件下于棕色瓶中可保存3d。 10.3 标准品 硫酸铵标准储备溶液(以氮计)(1.0g/L),或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 10.4 标准溶液配制 10.4.1 硫酸铵标准储备溶液(以氮计)(1.0g/L):称取105℃ 干燥2h的硫酸铵0.4720g加水溶解后稀释至100mL,混匀。此溶液每毫升相当于1.0mg氮。4 ℃条件下可保存1个月。 10.4.2 硫酸铵标准工作溶液 (0.10 mg/mL):准确吸取硫酸铵标准储备液 (1.0g/L)10.00 mL于100mL容量瓶内,以水稀释至刻度,混匀。此溶液每毫升相当于0.1mg氮。临用现配。 11 仪器和设备 11.1 分光光度计。 11.2 电热恒温水浴锅:100 ℃±1 ℃。 11.3 pH计:精度0.01。 11.4 10mL具塞玻璃比色管。 11.5 分析天平:感量为1mg和0.1mg。 11.6 定氮瓶:100mL、250mL和500mL。 11.7 匀浆机。 11.8 粉碎机。 12 分析步骤 12.1 试样制备 同5.1.1。 12.2 水分测定 同5.1.2。 12.3 试样消解 称取固体试样0.1g~0.5g、半固体试样0.2g~1g (精确至0.01g)、液体试样1mL(g)~5mL(g),移入干燥的100mL 或250mL 定氮瓶中,加入0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸,轻摇后于瓶口放一小漏斗,将定氮瓶以45°角斜放置于有小孔的石棉网上。缓慢加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加大火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热0.5h~1h。取下定氮瓶冷却至室温,小心加入20mL水,将内容物全部转移至100mL容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶内壁,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用。同时进行空白试验。 12.4 试样溶液的制备 量取2.0mL~5.0mL(精确至0.1mL)试样或试剂空白消化液于50mL 或100mL 容量瓶内,加1滴~2 滴对硝基苯酚指示剂溶液,摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色,再滴加乙酸溶液至溶液无色,以水稀释至刻度,混匀。 12.5 标准曲线的制作 吸取0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL 和1.00mL 硫酸铵标准使用溶液(相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg和100.0μg氮),分别置于10mL 比色管中。加4.0mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显色剂,以水稀释至刻度,混匀。置于100 ℃水浴中加热 15 min。取出用水冷却至室温后,移入1cm比色杯内,以零管为参比,于波长400nm 处测量吸光度值,根据标准曲线各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。 12.6 试样测定 吸取0.50mL~2.00mL(相当于氮<100μg)试样溶液和同量的试剂空白溶液,分别置于10mL比色管中。加4.0mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0mL显色剂,加水稀释至刻度,混匀。置于100 ℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后,移入1cm 比色杯内,以零管为参比,于波长400nm 处测量吸光度值,在标准曲线上查得待测液的浓度。 13 分析结果的表述 试样中蛋白质的含量按式(2)进行计算。 X =(c-c0)×V1 ×V3/（m
×V2 ×V4 ×1000×1000）×100×F…………………………(2) 式中: X ——试样中蛋白质的含量,单位为克每百克或克每百毫升(g/100g或g/100mL); c ——试样测定液中氮的含量,单位为微克(μg); c0 ——试剂空白测定液中氮的含量,单位为微克(μg); V1 ——试样消化液定容体积,单位为毫升(mL); V3 ——试样溶液总体积,单位为毫升(mL); m ——试样质量,单位为克或毫升(g或 mL); V2 ——制备试样溶液的消化液体积,单位为毫升(mL); V4 ——测定用试样溶液体积,单位为毫升(mL); 1000——由μg转化为 mg的换算系数; 1000 ———由 mg转化为g的换算系数; 100 ———由g/g转化为g/100g的换算系数; F ———蛋白质折算系数(见附录 C);
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