登革热和基孔肯雅热防控方案

附件 1-1

登革热和基孔肯雅热实验室检测方案

为指导各级医疗机构、疾控机构和相关实验室检测机构开展登革热和基孔肯雅热实验室检测工作，规范检测程序，提高检测质量，制定本方案。

一、检测对象

登革热和基孔肯雅热病例、共同暴露人群及专项调查人群，媒介伊蚊等。

二、样本采集、保存和运输

（一）样本采集。

1.人体血清样本。

①病例急性期血清。用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血5mL，及时分离血清，分装 2 份保存于做好标记的、带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内。

②病例恢复期血清。用无菌真空干燥管，采集患者发病 7 天后非抗凝血 5ml，及时分离血清，分装 2 份保存于做好标记的、带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内。采集时间与急性期血清间隔时间不少于 3 天。

2.蚊媒样本。

采集登革热、基孔肯雅热流行季节早晚活动高峰伊蚊，分类鉴定后，填写媒介伊蚊样本采集信息表，按照采集地点分装，每—管 10—20 只，低温保存。

（二）样本保存。

24 小时内检测的样本可置于 4℃环境中保存，1 周内检测的样本应置于-20℃环境中保存，需长期使用的样本应置于-70℃或以下环境中保存。

（三）样本运输。

按照《人间传染的病原微生物目录》对运输包装分类的有关要求，登革病毒的危害程度属于第三类病原微生物，血清和伊蚊标本应采用 B 类包装（编号：UN3373）。基孔肯雅病毒的危害程度属于第二类病原微生物，血清和伊蚊标本应采用 A 类包装（编号：UN2814）。样本运输时应遵守国家相关生物安全规定，采用低温运输，避免反复冻融。用于开展病原学监测的样本，应于 48小时内运送至地市级或省级疾控机构。

三、病例实验室检测

（一）病原学。

1.抗原检测。登革病毒常用 NS1 抗原检测，一般发病后 5 天内血液样本中 NS1 抗原检出率高，适用于现场快速检测，可用于早期诊断。

2.核酸检测。常采用实时荧光 RT-PCR 方法进行。用于登革病毒、基孔肯雅病毒早期诊断和登革病毒血清分型。境外输入病例应尽量全部采集样本。省外输入病例和本地病例按以下要求采集：当病例数量少于 20 例时，应尽量全部采集；介于 20—100例之间时，采集样本数不低于 20 例；超过 100 例时，采集样本数不低于病例数的 20％。

3.病毒培养分离。一般登革热发病 5 天内，基孔肯雅热发病7 天内血液样本病毒培养分离率较高，通常将样本接种至蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）中进行培养与分离，待其出现病变特征后，采用抗原或核酸检测手段鉴定病毒种类。

4.基因组序列分析。采用一代 Sanger 法或扩增子技术对登革病毒 E 基因、全基因组测序，对基孔肯雅病毒 E2、E1 基因和全基因组测序，测序技术经质控合格后，方可用于后续生物信息分析。优先选择与登革病毒、基孔肯雅病毒标准株、基因型明确以及分离日期和地区信息完整的病毒株基因组序列进行比较分析。二代测序平台覆盖深度应不低于 10×，三代测序平台覆盖深度应不低于 50×，全基因组测序覆盖度应不低于 98%。

登革热选择不少于 10%的核酸检测阳性样本开展 E 蛋白编码基因序列或全基因组测定和分析，阳性样本优先选取首例本地病例、指示病例、重症病例和死亡病例。对用于查明疫情性质和波及范围的聚集性病例核酸检测阳性标本开展病毒全基因组序列测定和分析。基孔肯雅热选择不少于 20%的核酸检测阳性样本开展病毒 E2 和 E1 蛋白编码基因序列或全基因组序列测定和分析。登革热、基孔肯雅热本地传播疫情样本选择，应兼顾不同时段、不同地区样本，优先选取首例本地病例样本。

不具备基因测序条件的县级疾控机构，应将样本送至地市级或省级疾控机构进行检测。省级疾控机构每月中旬将上月登革病毒和基孔肯雅病毒基因组序列及时上传至“病毒病病原监测预警系统”（https://www.ivdcvma.cn）。

（二）血清学。

1.特异性 IgM 抗体。采用 ELISA、免疫层析等方法检测，是辅助诊断登革热/基孔肯雅热急性期或近期感染的重要指标。

2.特异性 IgG 抗体。采用 ELISA、免疫荧光（IFA）、免疫层析等方法检测。登革热/基孔肯雅热患者恢复期血清 IgG 抗体阳转或滴度较急性期呈 4 倍及以上升高可以确诊。

3.中和抗体。采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方法检测，可用于分型。登革热/基孔肯雅热患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈 4 倍及以上升高可以确诊。

四、蚊媒实验室检测

将分类分装后的媒介伊蚊进行研磨，开展核酸分型检测，病毒核酸阳性的样本可由有能力或资质的地市级或省级疾控机构进行病毒培养分离和基因组序列分析。蚊媒核酸检测、病毒培养分离和基因组序列分析的检测方法同病例检测。

五、复核检测

地市级或省级疾控机构收到各县（市、区）登革热/基孔肯雅热首发病例或不同阶段聚集性疫情首发病例的样本后，需采用病原学或双份样本血清学方法复核检测，病毒核酸阳性样本应开展分型检测或基因测序。

六、结果报送和反馈

各县（市、区）登革热/基孔肯雅热首例输入病例和本地病例的实验室检测结果应在 24 小时内反馈样本送检单位。

省级疾控机构应于每月中旬将上月登革热、基孔肯雅热实验室检测与病原学监测结果报送至中国疾控中心。中国疾控中心应于每月底向国家疾控局报送上月检测报告，并向各省级疾控机构发布。

七、生物安全

登革热和基孔肯雅热实验室检测应按照《人间传染的病原微生物目录》规定要求开展，做好生物安全工作。登革病毒培养分离、未经培养的感染材料的操作在生物安全二级实验室进行、动物感染实验在动物生物安全二级实验室进行。基孔肯雅病毒培养分离在生物安全三级实验室进行、未经培养的感染材料的操作在生物安全二级实验室进行、动物感染实验在动物生物安全三级实验室进行。