流行性出血热诊断标准（WS 278—2026）

A 附 录 A

（规范性）

流行性出血热血清学诊断方法

A.1 IgM捕获ELISA法（MacELISA）检测流行性出血热IgM抗体

A.1.1 原理

根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗人μ链特异性抗体捕获待检测血清中的IgM抗体，加入酶标病毒蛋白抗原，也可加入病毒蛋白抗原或灭活病毒与相应的酶标特异性抗体，反应后加底物显色或发光。显色程度或发光强度与特异性IgM抗体含量呈正相关。

A.1.2 标记抗原法

A.1.2.1 实验材料

材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增减：

a) 洗板机、酶标仪、恒温孵箱或水浴箱（37℃±2℃）；

b) 10 μL～200 μL可调移液器、10 mL吸管；

c) 稀释血清用的试管、吸水纸；

d) 蒸馏水或去离子水；

e) 洗液（PBS-T）：磷酸盐缓冲液（PBS），含0.05％吐温20，pH 7.2；

f) 流行性出血热IgM抗体捕获法ELISA诊断试剂盒。

A.1.2.2 实验步骤

应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测，实验步骤如下：

a) 将阴、阳性对照血清，待检血清用稀释液按1:100稀释，加入已包被抗人μ链抗体的酶标板中，100 μL/孔，置37℃孵育1 h，同时设空白对照；

b) 弃去上清，用PBS-T漂洗5遍；

c) 将适当稀释的酶标记的病毒抗原加入反应板相应孔内，100 μL/孔，37℃孵育1 h；

d) 弃酶标抗体，用洗涤液洗涤5遍，吸水纸上扣干；

e) 加显色液：于各反应孔内加显色液,37℃,避光5 min～10 min，至阳性对照孔显现蓝色；

f) 加终止液（4N H2SO4）于每反应孔，50 μL/孔；

g) 在30 min内于450 nm波长处读取每孔的吸光度。

A.1.2.3 结果判断

应结合所选用试剂盒进行结果判断，规则如下。

a) 酶标仪读数法：阳性对照孔（P）OD值与阴性对照孔（N）OD值处于预测范围， P/N≥2.1,对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD值比值≥2.1，则标本为流行性出血热IgM抗体阳性，反之阴性（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记,若大于0.05按实际数值计算，但应小于0.2）。

b) 目测法：未加终止液前，在阳性对照血清为深蓝色、阴性对照血清为无色的情况下，若样品孔颜色比临界校准血清孔深者为阳性，样品孔颜色比临界校准血清孔浅者为阴性。

A.1.2.4 意义

IgM抗体阳性,表示患者新近汉坦病毒感染，适用于流行性出血热早期诊断。

A.1.3 标记抗体法

A.1.3.1 实验材料

材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增减：

a) 洗板机、酶标仪、恒温孵箱或水浴箱（37℃±2℃）；

b) 10 μL～200 μL可调移液器、10 mL吸管；

c) 稀释血清用的试管、吸水纸；

d) 蒸馏水或去离子水；

e) 流行性出血热IgM抗体捕获法ELISA诊断试剂盒。

A.1.3.2 实验步骤

应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测，实验步骤如下：

a) 将阴、阳性对照血清，待检血清用稀释液1:100倍稀释，分别加入反应板相应孔内，100 μL/孔，置37℃孵育1 h；

b) 弃去血清,用洗涤液洗涤5次；

c) 将汉坦病毒抗原、对照病毒抗原按照试剂盒说明书，分别用稀释液稀释至工作浓度，分别加入平行的两反应孔中，100 μL/孔，37℃孵育1 h；

d) 弃去抗原，用洗涤液洗涤5次；

e) 将辣根过氧化物酶标记的抗汉坦病毒特异性抗体按照试剂盒说明书用稀释液稀释至工作浓度，加入每个反应孔中,100 μL/孔,37℃孵育1 h；

f) 弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤5次；

g) 加显色液于每反应孔,100 μL/孔，37℃避光5 min～10 min，至阳性对照孔显出蓝色，加终止液（4N H2SO4）于每反应孔，50 μL/孔；

h) 在30 min内于450 nm波长处读取每孔的吸光度。

A.1.3.3 结果判断

结果判断规则如下。

a) 酶标仪读数法：阳性对照孔（P）OD值与阴性对照孔（N）OD值处于预测范围，P/N≥2.1,对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD值比值≥2.1,则标本为流行性出血热IgM抗体阳性，反之阴性（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记,若大于0.05按实际数值计算，但应小于0.2）。

b) 目测法：未加终止液前，在阳性对照血清孔为深蓝色、阴性对照血清孔为无色的情况下，若样品孔与对照血清孔相比显示明显的蓝色则为阳性，若比对照血清孔浅或相似者则为阴性。

A.1.3.4 意义

IgM抗体阳性,表示患者新近汉坦病毒感染，适用于流行性出血热早期诊断。

A.2 IgM捕获法胶体金标记试纸条快速检测IgM抗体

A.2.1 实验材料

材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增减：

a) 胶体金标记试纸条快速IgM检测试剂盒；

b) 滴管或加样器。

A.2.2 实验步骤

应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测，实验步骤如下：

a) 如果试剂盒储存于4℃冰箱,请将所有实验用试剂与器材取出，平衡至室温；

b) 打开密封的铝箔袋，取出试剂盒，平放于水平桌面上，做好标记；

c) 用滴管或加样器从盛有血清或血浆的试管中取2滴～3滴或100 μL～150 μL样品滴加于测试盒上的样品孔内，于15 min内观察测试结果。