流行性出血热诊断标准（WS 278—2026）

A.2.3 结果判断

结果判断规则如下：

a) 阳性：可见质控线与试验线2条紫红色带；

b) 阴性：只有一条质控线出现；

c) 无效：如果未能观察到质控线出现，则检测无效，应重新检测；

d) 阳性结果可在加样后1 min～2 min显示出来，但阴性结果判断应在加样15 min后方可判定。

A.2.4 意义

IgM抗体阳性,表示患者新近汉坦病毒感染，可用于流行性出血热早期诊断。

A.3 间接酶联免疫吸附试验检测抗汉坦病毒IgG抗体

A.3.1 原理

将重组汉坦病毒蛋白抗原包被酶标板，利用汉坦病毒蛋白抗原高免疫原性结合样本中病毒特异性抗体，再加酶标记的抗人IgG抗体进行检测，反应后加底物显色或发光。显色程度或发光强度与特异性IgG抗体含量呈正相关。

A.3.2 实验材料

材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增减：

a) 洗板机、酶标仪、恒温箱或水浴箱（37℃±2℃）；

b) 10 μL～200 μL可调移液器、10 mL吸管；

c) 稀释血清用的试管、吸水纸；

d) 蒸馏水或去离子水；

e) 流行性出血热IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒。

A.3.3 实验步骤

应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测，实验步骤如下：

a) 将待检血清用稀释液从1:100开始做2倍连续稀释至1:1600，加入抗原孔，100 μL/孔，同时设阴、阳性对照，37℃孵育1 h；

b) 弃去血清，用洗涤液洗涤6次；

c) 加酶结合物，根据说明书用稀释液按工作浓度稀释，100 μL/孔，37℃孵育1 h；

d) 弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤6次；

e) 加显色液：于各反应孔内加A/B液各1滴，37℃，避光5 min～10 min，至阳性对照孔出现蓝色；

f) 加终止液于每反应孔，50 μL/孔。

A.3.4 结果判断

应结合所选用试剂盒进行结果判断，规则如下。

a) 酶标仪读数法：在30 min内于450 nm波长处读取每孔的吸光度，阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值,即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为流行性出血热IgG抗体阳性，反之阴性（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算，但应小于0.2）。

b) 目测法：未加终止液前，在阳性对照血清为深蓝色、阴性对照血清为无色的情况下，若样品孔与对照血清孔相比显示明显的蓝色则为阳性，若比对照血清孔颜色浅或相似者则为阴性。

A.3.5 意义

阳性结果,表明曾受到汉坦病毒感染,＞1:100有诊断参考意义；恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或以上升高，或阳转，则可确诊。

A.4 免疫荧光试验（IFAT）检测IgG抗体

A.4.1 原理

采用汉坦病毒感染细胞，如Vero或Vero-E6细胞等，制备抗原片，结合血清或血浆样本中病毒特异性IgG抗体，然后使用荧光标记抗人IgG抗体进行检测，可在荧光显微镜下直接观察特异性荧光显色，阳性结果说明患者曾感染汉坦病毒，如果恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。

A.4.2 实验材料

材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增减：

a) 抗原片：家鼠型和姬鼠型汉坦病毒标准毒株感染Vero E6制备，低温干燥保存；

b) 阳、阴性对照：患者恢复期血清（阳性对照）、阴性血清；

c) 荧光素标记羊抗人（或兔抗人）IgG抗体；

d) 常用稀释液：pH 7.2～7.4,0.02mol/L PBS，伊文思蓝等；

e) 荧光显微镜。

A.4.3 实验步骤

应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测，实验步骤略述如下：

a) 用PBS稀释待检血清，从1:20开始做4倍连续稀释至1:320，或至所需要的稀释度；

b) 取出抗原片，用PBS漂洗；

c) 用加样器，按照稀释度从高到低的顺序依次加入待检血清,加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清,下排为恢复期血清），同时设阳性、阴性对照，在37℃湿盒孵育30 min～40 min；

d) 用PBS洗涤3次，每次5 min；

e) 用含伊文思蓝PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃湿盒孵育30 min，然后步骤同d）；

f） 荧光显微镜观察结果。

A.4.4 结果判断

细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。可根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，将免疫荧光反应大致区分为1个～4个“+”。阳性细胞数:＜25% 为“ + ”,25%～50% 为“ + + ”,51%～75% 为“ + + + ”，＞75% 为“ + + + + ”；出现特异性荧光者为“+”（阳性）， 无特异性荧光者为“-”（阴性）。

检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（+ +）最高血清稀释度的倒数表示。

A.4.5 意义

阳性结果,表明曾受到汉坦病毒感染，大于1:20有诊断参考意义。

恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高，或阳转则可确诊。