B.2.3 实验步骤 应参照所选用试剂盒说明书进行相关检测，参考步骤如下。 a) 病毒RNA的提取：按试剂说明书操作，制备模板RNA。 b) 实时荧光RT-PCR扩增：实时荧光定量RT-PCR扩增反应配置体系，参考如下：RNA模板5 μL，酶0.5 μL，缓冲液12.5 μL，引物各0.5 μL(共2对，4条，浓度为20µM)，探针各0.25 μL，加水至总体积25 μL。推荐反应条件为50℃ 30 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s反应40个循环。具体反应体系可根据所使用的试剂和荧光PCR仪器进行优化调整。 B.2.4 结果判断 以荧光PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值），以Ct＜35荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图成“S”形的标本，可判断为相应的汉坦病毒核酸检测阳性，Ct>38可判断为阴性，Ct值处于35～38之间者，可判断为灰区，需采用另一套引物探针或其他检测方法进行检测判断。 B.2.5 意义 排除污染后，检出病毒核酸可确诊汉坦病毒感染，用于早期诊断，阴性结果不能排除病毒感染。
B.3 病毒分离 B.3.1 原理 病毒不能独立生存，需依赖宿主细胞完成自我复制。Vero-E6 和Vero细胞对汉坦病毒敏感，可用于汉坦病毒的分离、培养，一般不产生显著病变，可通过观察细胞内和培养上清中，病毒蛋白抗原和核酸的变化情况，检验病毒的存在和型别。汉坦病毒的分离培养需在生物安全二级或以上级别实验室内进行。 B.3.2 实验材料 材料与试剂如下，可根据所在实验室的习惯与规程有所增减。 a) 10 μL～200 μL、1 mL移液器、无菌吸头。 b) 96孔、24孔组织培养板或T25细胞培养瓶或细胞培养管。 c) Vero E6细胞或其他敏感细胞,Vero E6细胞一般较其他细胞敏感。 d) CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜。 e) 细胞生长液、维持液与Hank's液。 f) 患者血标本或宿主动物标本。无菌采集发病后5 d内静脉血3 mL，置冰壶中，于实验室中分离血清，接种细胞培养；不能及时接种细胞者可置-70℃保存。污染的血清要先用双抗（青霉素、链霉素，最终浓度各500 000 U/mL）,4℃ 2 h处理后接种细胞。 B.3.3 实验步骤 可根据所在实验室的规程有所调整，具体步骤参考如下。 a) 样本处理和稀释：患者急性期血清标本适当稀释后（如1:10、1:20等）可直接用于病毒分离，在病毒细胞培养分离设置一个正常人血清同样比例稀释作为阴性对照。 b) 细胞接种：将培养好的Vero-E6或Vero单层细胞上清弃掉，用Hank's液洗涤2遍，用Hank's液1:10稀释的早期血清标本0.5 mL～1 mL接种T25细胞培养瓶中长成单层的细胞。在37℃温箱吸附2 h后用无菌Hank's洗涤细胞层1次～2次，每次5 mL，最后加入维持液5 mL，37℃培养。每隔3 d～4 d换培养液。 c) 培养至第10 d～14 d刮取少量细胞点抗原片进行免疫荧光检测，如果荧光检测阳性，则收集上清接种新鲜细胞进行病毒培养，确定病毒型别；如果检测结果仍为阴性，则收集培养液，冻存于-70℃或液氮中以备重新检测，细胞需继续传代。 d) 连续传代：用胰酶消化以上步骤中检测为阴性的细胞，用3 mL～4 mL新鲜培养液悬浮细胞，取1/2 (1.5 mL～2 mL)细胞悬液与大约同等数量的新鲜制备的正常细胞联合培养，重复步骤c），检测至第3代。取剩余1/2 (1.5 mL～2 mL)细胞悬液离心后保存于-70℃待查。 e) 病毒抗原和核酸检测：刮取少量细胞制备抗原片，利用汉坦病毒特异性抗体进行免疫荧光检测，如果荧光检测阳性，说明存在病毒复制，应参照汉坦病毒核酸检测方法，提取核酸，进行序列分析, 并妥善保存。连续传代至第3代，检测仍为阴性者，可判断为阴性，相应培养物可按废弃物处理。 f) 废弃物处理：所有实验用品都应严格按照有关实验室安全管理条例处理方法高压处理。 B.3.4 结果判断 结果判断规则如下： a) 免疫荧光法检测用于分离汉坦病毒细胞，若荧光呈阳性，提示在细胞中有汉坦病毒复制，若阴性，提示细胞中未发生病毒显著复制。 b) 用于分离汉坦病毒的传代细胞中，病毒基因组核酸检测阳性，提示在细胞中有汉坦病毒复制，若阴性，提示细胞中未发生病毒显著复制。 B.3.5 意义 阳性结果，表明患者汉坦病毒感染；阴性结果，不能排除诊断。 |
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