流行性出血热诊断标准（WS 278—2026）

附 录 B

（规范性）

流行性出血热病原学诊断方法

可采用逆转录聚合酶链式扩增（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative Real-time RT-PCR , qRT-PCR）、基因测序或其他经过评估合格的病毒基因组核酸检测方法进行检测，检出特异性病毒核酸具有确诊意义。

B.1 流行性出血热病毒RT-PCR法核酸检测

B.1.1 原理

PCR技术是在特异性引物存在的条件下，利用双链DNA分子碱基配对原则，在体外扩增DNA片段，其特异性取决于寡核苷酸引物的序列。引物与待扩增片段两条链两段DNA序列分别互补结合后，在DNA聚合酶催化下，引导引物的5′端向3′端方向延伸合成新链，是温度控制下可重复进行的热变性、复性延伸的温控循环过程，可使DNA产量呈指数上升。汉坦病毒为负链RNA病毒，PCR扩增检测前需经过逆转录酶作用，合成第一条cDNA链，再进行PCR扩增，即RT-PCR。设计不同特异性引物可扩增不同种汉坦病毒基因。从患者标本中提取病毒基因组RNA，利用适当方法进行核酸检测，可通过扩增片段大小鉴定、基因组序列比对分析、特异性引物探针序列等方式，达到病原体鉴定和基因分型目的。

B.1.2 实验材料

材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增减：

a) 急性期患者血标本或分离的汉坦病毒；

b) RNA提取试剂盒；

c) 汉坦病毒核酸扩增引物及分型引物（表B.1）；

d) 逆转录与PCR扩增试剂盒；

e) 移液器（10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）及配套吸头、PCR反应管、离心管（1.5mL）及管架、台式高速离心机、普通冰箱、旋涡混合器、PCR扩增仪等。

表B.1 流行性出血热病毒RT-PCR法核酸检测及基因分型参考引物序列

B.1.3 实验步骤

应参照所选用试剂盒说明书进行相关检测，参考步骤如下。

a) 病毒RNA的提取：按试剂说明书操作，制备模板RNA。

b) 逆转录合成cDNA：可用随机引物或病毒特异性引物，按商业化逆转录酶说明书进行。

c) PCR扩增: 根据实验室内所使用病毒核酸PCR扩增试剂盒特点，通用型正、反向引物配置第一轮PCR体系，进行第一轮PCR扩增。推荐反应条件为94℃预变性2 min，然后94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，反应40循环，最后72℃延伸10 min。第二轮分型PCR扩增体系配置采用分型正向引物与反向引物。推荐反应条件为94℃预变性2 min，然后94℃变性30 s，55℃退火30 s， 72℃延伸1 min，反应30循环，最后72℃延伸10 min。

d) 电泳分析：1.5%浓度琼脂糖电泳分析，根据扩增条带大小确定病毒型别。若条带的分子量与预期片段大小相同，则表明为特异性扩增产物。

必要时，可进行：

e) PCR片段的回收和核苷酸序列测定：切下特异分子量条带，用凝胶电泳回收试剂盒回收纯化所扩增的DNA片段（按相应试剂盒说明书进行），测序仪测序。

B.1.4 意义

排除PCR污染后，扩增到特异性条带可确诊汉坦病毒感染，根据片段大小和序列测定可对汉坦病毒进行分型，阴性结果不能排除诊断。

B.2 流行性出血热病毒qRT-PCR法核酸检测

B.2.1 原理

在我国，流行性出血热主要由姬鼠型（汉滩型）和家鼠型（首尔型）汉坦病毒引起，根据病毒基因组序列特征，设计特异性引物和特异性荧光标记核酸探针，可快速实现病毒分型检测。探针结合部位位于引物结合区域内，其5’端和3’端可分别标记不同的荧光素，称为报告荧光基团（用R表示）和淬灭荧光基团（用Q表示，淬灭荧光基团也可用小沟结合物MGB）。当引物和探针同时与目的基因片段结合时，探针R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR扩增延伸到探针结合部位时，Taq酶发挥5’→3’外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，探针上的R基团游离释放，所发出的荧光不再为Q基团所淬灭，可被检测仪接收识别，随着PCR循环扩增反应的延续，R和Q基团游离于溶液中的量不断增加，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。qRT-PCR可定性或定量检测标本中的病毒核酸。

B.2.2 实验材料

材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增减：

a) 急性期患者血标本或分离的汉坦病毒；

b) RNA提取试剂盒；

c) 汉坦病毒核酸实时荧光RT-PCR扩增检测引物（表B.2），或其他流行性出血热实时荧光RT-PCR检测试剂盒；

d) 移液器（10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）及配套吸头、PCR反应管、离心管（1.5mL）及管架、台式高速离心机、普通冰箱、旋涡混合器、实时荧光PCR仪等。

表B.2 流行性出血热病毒实时荧光RT-PCR法核酸检测参考引物探针序列