E.4.3.4 所需抗菌药物质量或稀释液体积的计算 使用以下公式来计算所需抗菌药物的质量(式 E.1)或稀释液体积(式 E.2)： m =V ×ρ/P…………………………(E.1) V =m ×P/ρ………………………(E.2) 式中： m ———抗菌药物(粉状)的质量，单位为克(g); V ———稀释液的体积，单位为升(L); ρ ———储备液的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL); P ———抗菌药物的效力，单位为毫克每克(mg/g)。 E.4.3.5 2倍质量浓度抗菌药物工作液的制备 以庆大霉素为例，将抗菌药物储备液按照表 E.4要求进行稀释，分别制备系列2倍质量浓度庆大霉素工作液。 表 E.4 2倍质量浓度庆大霉素工作液的制备
参照表 E.4的方法，分别制备表 E.3中其他抗菌药物系列2倍质量浓度的工作液。 E.4.3.6 制板 以庆大霉素为例，按照表E.3中 A 板的布局，分别移取50μL质量浓度为512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL和1μg/mL的2倍质量浓度庆大霉素工作液，加到96孔标准微孔板庆大霉素所在行对应的第11、10、9、8、7、6、5、4、3和2孔中。按此做法依次将其他待测抗菌药物的系列2倍质量浓度工作液分别加至相对应的微孔板中，备用。制备好的抗菌药物微量稀释板应尽快使用，如不能及时使用，应将其密封并在低于-20 ℃条件下保存。微量稀释板中的抗菌药物在低于-20 ℃条件下可稳定保存数月。保存期间可用质控菌种检测其稳定性。 E.4.4 待测菌悬液的制备 挑取 E.4.1中经复苏、活化后在培养基上生长良好的待测菌种新鲜菌落，用比浊仪于盛有2mL~5mL无菌生理盐水的玻璃试管中制成1.0麦氏浊度菌悬液，或用分光光度计在625nm 波长下测定其吸光度(OD值)，使 OD值范围为0.16~0.20。此时，菌悬液中菌的浓度约为3×108 CFU/mL。由于唾液链球菌嗜热亚种和德氏乳杆菌的某些株可能出现1.0麦氏浊度菌悬液中菌的浓度低于3×108 CFU/mL的现象，在此情况下应调整麦氏浊度稍高于1.0，确保菌浓度达3×108 CFU/mL时方可使用。对于双歧杆菌而言，应使用提前一天置于厌氧环境中的 LSM-半胱氨酸培养基来制备菌悬液，其他细菌菌悬液的制备参照 CLSI中相近种属进行。 E.4.5 菌悬液接种 依受试菌种不同，选择表 E.5推荐的相应培养基将 E.4.4中制备好的菌悬液稀释500倍后，依次加至 E.4.3.6制备好的抗菌药物微量稀释板中，每孔50μL。冷冻保存的抗菌药物微量稀释板使用前应置于厌氧条件下快速融化后方可使用。如使用包被有抗菌药物的商品化微量稀释板，则选用表 E.5中推荐的培养基，将E.4.4中制备好的菌悬液稀释1000倍后加至商品化抗菌药物微量稀释板中，每孔100μL。整个接种过程应在30min内完成。 表 E.5 不同菌种进行抗菌药物耐药性测定用培养基和培养条件
E.4.6 培养 将接种菌悬液后的微量稀释板于表 E.5所推荐的相应条件下培养。培养时微量稀释板不宜堆放过高，以确保每块微量稀释板在相同的温度、湿度、通气量等条件下培养。 E.4.7 结果读取 E.4.7.1 微量稀释板培养48h后，记录每种抗菌药物完全抑制待测菌种生长的 MIC。 E.4.7.2 结果记录前，应首先检查阳性对照孔和阴性对照孔，若阳性对照孔细菌生长良好、阴性对照孔无细菌生长且质控菌种对所有抗菌药物的 MIC 值均在质控范围内，则各抗菌药物对待测菌种的 MIC值结果可信，否则结果不可信，应重复试验。 E.4.7.3 若出现待测菌种不连续(或间断)生长的情况，则结果不可信，应重复试验。 E.4.8 结果判定 参照表 E.6列出的折点值，报告待测菌种对受试抗菌药物的敏感(低于或等于折点值)或耐药(高于折点值)结果。
E.4.9 质控菌株的质控标准 试验用质控菌株的 MIC值应在规定范围内，具体见表 E.7。 表 E.7 质控菌株 MIC值的质控范围 单位为微克每毫升(μg/mL)
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