食品安全国家标准 食品用菌种安全性评价程序

附 录 E

食品用细菌菌种抗菌药物耐药性的测定

(微量肉汤稀释法)

E.1 范围

本方法规定了食品用细菌菌种抗菌药物耐药性的测定方法。

本方法适用于食品用细菌菌种抗菌药物耐药性的测定。

E.2 设备和材料

除微生物实验室常规设备外，其他设备与材料如下。

E.2.1 恒温培养箱：28 ℃±1 ℃、32 ℃±1 ℃和36 ℃±1 ℃。

E.2.2 厌氧培养装置：厌氧罐(袋、盒等)或厌氧培养箱。

E.2.3 比浊仪。

E.2.4 分光光度计：625nm。

E.2.5 恒温水浴：28 ℃~55 ℃。

E.2.6 pH 计：25 ℃下精度为±0.1。

E.2.7 电子天平：感量分别为0.1g和0.001g。

E.2.8 具盖(或塞)试剂瓶：容量分别为150mL、250mL、500mL、1000mL。

E.2.9 无菌吸管：量程分别为0.05mL(具0.001mL刻度)、0.1mL(具0.01mL刻度)、1.0mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)，或同等量程的移液器及配套吸头。

E.2.10 无菌培养皿：直径90mm。

E.2.11 标准微孔板：96孔。

E.2.12 无菌滤膜：孔径0.22μm。

E.2.13 具盖(塞)无菌试管：10mL、20mL。

E.3 培养基和试剂

E.3.1 MRS琼脂培养基

蛋白胨10.0g、牛肉粉10.0g、酵母提取物(浸粉)5.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、七水磷酸氢二钾(K₂HPO₄·7H₂O)2.0g、三水乙酸钠(NaCH₃CO₂·3H₂O)5.0g，柠檬酸铵[(NH₄)2HC₆H₅O₇]

2.0g、七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.1g、四水硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)0.05g、琼脂粉10.0g~15.0g

(视琼脂的凝胶强度可酌情增减琼脂粉的量)，加入蒸馏水1000mL(当用于耐药性测定时，不加琼脂粉，且加入蒸馏水的量为500mL)，加热充分溶解后，调节pH 至6.4±0.1，分装后121℃高压灭菌15min。

于水浴中冷却至48 ℃后倾注平板，每板15mL~20mL，静置凝固后备用。制备好的平板可于塑料袋中密封包装，2 ℃~8 ℃下避光保存，1周内使用完毕。

E.3.2 MRS-半胱氨酸琼脂(MRS-Cys琼脂)培养基

E.3.2.1 L-半胱氨酸储备液的配制：称取0.3gL-半胱氨酸盐酸盐，加入10mL蒸馏水中，充分溶解后用0.22μm 滤膜过滤除菌，过滤除菌后的 L-半胱氨酸储备液可于2 ℃~8 ℃下避光保存，1周内使用完毕。

E.3.2.2 MRS-Cys琼脂培养基平板制备：取 E.3.1在水浴锅中冷却至48 ℃左右的 MRS基础培养基100mL，加入E.3.2.1中制备好的L-半胱氨酸储备液1mL，混匀后倾注平板，每板15mL~20mL，静置

凝固后备用。制备好的平板可密封包装于塑料袋中，于2 ℃~8 ℃下避光保存，1周内使用完毕。

E.3.3 M17-乳糖琼脂培养基

E.3.3.1 M17-基础培养基的配制：胰蛋白胨5.0g、大豆蛋白胨5.0g、牛肉粉5.0g、酵母提取物(浸粉)2.5g、抗坏血酸(C₆H₈O₆)0.5g、七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.25g、五水甘油磷酸钠(C₃H₇PO₆Na₂·5H₂O)19.0g、琼脂粉10.0g~15.0g(视琼脂的凝胶强度可酌情增减琼脂粉的量)，加蒸馏水950mL，加热溶解，调节pH 至7.4±0.1，分装后121 ℃高压灭菌15min，置于水浴中冷却至48 ℃备用。

E.3.3.2 乳糖储备液的配制：称取5.0g乳糖于50 mL 蒸馏水中，充分溶解后用0.22μm 滤膜过滤除菌。

E.3.3.3 M17-乳糖琼脂培养基的制备：取 E.3.3.1中制备好的 M17基础培养基95mL，加入 E.3.3.2制备好的乳糖储备液5mL，混匀(加入过程中避免气泡产生)后倾注平板，每板15mL~20mL，静置凝固。制备好的平板可密封包装于塑料袋中，2 ℃~8 ℃下避光保存，2周内使用完毕。

E.3.4 Elliker琼脂培养基

胰酶消化的酪蛋白20.0g、酵母提取物(浸粉)5.0g、明胶2.5g、葡萄糖5.0g、乳糖5.0g、蔗糖5.0g、氯

化钠4.0g、三水乙酸钠(NaCH₃CO₂·3H₂O)1.5g、抗坏血酸(C₆H₈O₆)0.5g、琼脂粉10.0g~15.0g(视

琼脂的凝胶强度酌情增减加入琼脂粉的量)，加入蒸馏水1000mL，加热溶解后，调节pH 至7.0±0.1，分装后121℃高压灭菌15min，于水浴中冷却至48℃后倾注平板，每板15mL~20mL，静置凝固。制备好的平板可密封包装于塑料袋中，2 ℃~8 ℃下避光保存，2周内使用完毕。

E.3.5 IST培养基

水解酪蛋白11.0g、蛋白胨3.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠3.0g、可溶性淀粉1.0g、磷酸氢二钠2.0g、乙酸钠1.0g、甘油磷酸镁0.2g、葡萄糖酸钙0.1g、硫酸钴0.001g、硫酸铜0.001g、硫酸锌0.001g、硫酸铁0.001g、氯化镁0.002g、维生素 K0.001g、维生素 B120.001g、盐酸 L-半胱氨酸0.02g、L-色氨酸0.02g、维生素 B60.003g、泛酸0.003g、烟碱0.003g、维生素 H0.0003g、维生素B10.00004g、腺嘌呤0.01g、鸟嘌呤0.01g、黄嘌呤0.01g、尿嘧啶0.01g，加入蒸馏水至1000mL(用于耐药性测定时，加入蒸馏水至500mL)，加热溶解后，调节pH 至7.6±0.1，分装后121 ℃高压灭菌15min。制备好的培养

基可密封后于2 ℃~8 ℃下避光保存，2周内使用完毕。对于1000 mL 的IST 培养基中含量少于0.001g的物质，可事先配制100倍~1000倍的浓缩液，继而按需要量换算成需要添加浓缩液的量。

E.3.6 IST乳糖培养基

无菌操作取 E.3.5中制备好的IST 培养基90mL，加入 E.3.3.2制备好的乳糖储备液10mL，充分混匀(当用于耐药性测定时，IST 培养基制备时加入蒸馏水的体积减半)。制备好的培养基可密封后于2 ℃~8 ℃下避光保存，2周内使用完毕。

E.3.7 LSM 培养基

取E.3.5中制备好的IST培养基90mL，加入E.3.1中制备好的不含琼脂粉的 MRS培养基10mL，混匀。当用于耐药性测定时，IST 培养基和不含琼脂粉的 MRS培养基制备时均只加1/2体积的蒸馏水。

调节pH 至6.9±0.1，121 ℃高压灭菌15 min。制备好的培养基可密封后于2 ℃~8 ℃下避光保存，2周内使用完毕。

E.3.8 LSM-半胱氨酸培养基(LSM-Cys培养基)

取 L-半胱氨酸盐酸盐0.03g，加至E.3.7中制备好的100mL未灭菌的LSM 培养基中，混匀至完全溶解。当用于耐药性测定时，IST 培养基和不含琼脂粉的 MRS培养基制备时均只加1/2体积的蒸馏水，调节pH 至6.9±0.1，121℃高压灭菌15min。制备好的培养基可密封后于2℃~8℃下避光保存，1周内使用完毕。

E.3.9 CAMHB培养基

牛肉浸粉3.0g、酸水解酪蛋白17.5g、可溶性淀粉1.5g、氯化钙0.05g，加入蒸馏水1000mL(用于耐药性测定时，加入蒸馏水的量为500mL)，加热溶解后，调节pH 至7.5±0.1，分装后121 ℃高压灭菌15min。制备好的培养基可密封后于2 ℃~8 ℃下避光保存，2周内使用完毕。