附录 C 食品用酵母的致病性试验方法
C.1 范围 本方法规定了食品用酵母的致病性试验方法。 本方法适用于食品用酵母的致病性评价。
C.2 设备和材料 除微生物实验室常规设备外，其他设备和材料如下： C.2.1 恒温培养箱：28 ℃±1 ℃。 C.2.2 电子天平：感量为0.1g。 C.2.3 锥形瓶：容量为500mL。 C.2.4 无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。 C.2.5 显微镜：10×~100×。 C.2.6 微量移液器及配套吸头：量程为100μL~1000μL 。 C.2.7 血球计数板。 C.2.8 注射器：量程为100μL~1000μL。 C.2.9 小鼠灌胃针头。 C.2.10 温湿度计。温度计允许误差：±1 ℃，湿度计允许误差：±3% RH。 C.2.11 接种环。 C.2.12 离心机：离心力≥3000g。 C.2.13 无菌培养皿：直径90mm。 C.2.14 无菌量筒：容量100mL。
C.3 培养基和试剂 C.3.1 无菌生理盐水：见 A.3.1。 C.3.2 麦芽汁琼脂平板：见 B.3.2。 C.3.3 麦芽汁培养基：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15min，备用。 如菌种在麦芽汁琼脂培养基上的生长状态不理想，可选用适于该菌种生长的其他培养基。
C.4 实验动物 见 A.4。
C.5 操作步骤 对于国内外均无使用历史的菌种，或国内外虽有使用历史，但对人和动物健康有不良影响记载或报道的菌种，必须使用腹腔注射和经口灌胃2种途径给予动物受试物，以评价受试物不同给予途径对动物的致病性。 对于国内外有使用历史且使用过程中未发现对人和动物健康有不良影响的菌种，可选择经口灌胃单一途径给予动物受试物，以评价受试物对动物的致病性。 C.5.1 腹腔注射 C.5.1.1 菌种活化：根据送检菌种的保存状态，接种于麦芽汁琼脂平板或适于该菌生长的最适液体培养基中，并置于适宜的培养条件(包括培养温度、湿度、通气量等)下培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)，确认为纯培养后备用。 C.5.1.2 菌悬液制备：将菌种接种麦芽汁琼脂平板，28 ℃±1 ℃培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)后，刮取平板上的菌落，将其悬浮于无菌生理盐水中，充分混匀后，用血球计数板计数，并用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度，使菌悬液中菌的最终浓度不低于5.0×107 CFU/mL。 C.5.1.3 腹腔注射：小鼠不少于40只，雌雄各半，随机分成4组(每组不少于10只)，包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组及雌性小鼠菌悬液组，每只小鼠腹腔注射0.2mL，即每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107 CFU。 C.5.1.4 动物观察：动物腹腔注射后每天观察1次，至少连续观察21d，观察指标同 A.5.1.4。 C.5.2 经口灌胃 C.5.2.1 菌种培养 将菌种接种到麦芽汁培养基中，28 ℃±1 ℃培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)后，备用。 C.5.2.2 菌数预估 无菌吸取C.5.2.1的培养液，分别加至2个无菌离心管中，每管1mL，3000g 离心10min，弃去上清液后，用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度并计数，使最终菌悬液中菌的浓度分别不低于2.5×108 CFU/mL和6.25×108 CFU/mL，并分别记录每毫升培养液离心后所得沉淀物中酵母菌数调整至2.5×108 CFU/mL和6.25×108 CFU/mL时加入无菌生理盐水的体积(mL)。 C.5.2.3 菌悬液制备 C.5.2.3.1 培养上清液的制备：根据受试动物总数和每只动物的灌胃体积计算所需要的受试菌种培养液用量，继而将培养液一分为二，3000g 各离心10min后，将上清液分别转至100mL无菌量筒中，1份上清液作为菌悬液原液的制备，另1份上清液冷冻浓缩至原体积的2/5，作为2.5倍浓缩上清液，备用。 C.5.2.3.2 菌悬液原液的制备：按照 C.5.2.2中获得的酵母菌终浓度达到2.5×108 CFU/mL所需要的生理盐水体积，根据离心的培养物体积，按相同比例加入 C.5.2.2获得的上清液，调整离心后的沉淀物使其酵母菌数达到2.5×108 CFU/mL(上清液量不够时可用空白培养基补齐)。 C.5.2.3.3 浓缩菌悬液的制备：按照 C.5.2.2中获得的酵母菌终浓度达到6.25×108 CFU/mL所需要的生理盐水体积，根据离心的培养物体积，按相同比例加入 C.5.2.2获得的培养上清液2.5倍浓缩液，调整离心后的沉淀物使其菌数达到6.25×108 CFU/mL。 C.5.2.4 灌胃 小鼠不少于80只，雌雄各半，随机分成8组(每组不少于10只)，包括雄性小鼠培养基对照组、雄性小鼠菌悬液组、雄性小鼠2.5倍浓缩培养基对照组、雄性小鼠2.5倍浓缩菌悬液组、雌性小鼠培养基对照组、雌性小鼠菌悬液组、雌性小鼠2.5倍浓缩培养基对照组、雌性小鼠2.5倍浓缩菌悬液组。各组均以20mL/kg体重的体积给小鼠灌胃1次，使受试物组每只小鼠灌胃菌量分别为1.0×108 CFU(原液组)和2.5×108 CFU(2.5倍浓缩液组)，灌胃前应禁食过夜(16h)，灌胃后3h~4h喂食。 C.5.2.5 观察 动物经口灌胃后每天观察1次，至少连续观察21d，观察指标同 A.5.1.4。
C.6 结果与报告 对 C.5.1和 C.5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价，内容同 A.6。 |
